抗牛ifn-γ单克隆抗体制备及elisa检测方法建立

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华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果．尽我所知，除了文中特另4加以标注和致谢的地3-外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材科，指导教师对此进行了审定．与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生签名：乏5训时闻：W。锌‘月6日学位论文使用授权书．煳⋯始加1摊名：懈明、，签名日期：’寸o≤年‘月8日签名日期：沁。解6月g日注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之问 华中农业大学2006年硕十学位论文摘要Y干扰素(IFN．g)主要由被抗原、有丝分裂素(ConA,PHA)等活化的Thl细胞、CD8+细胞和NK细胞产生，除具有抗病毒、抗肿瘤活性外，还具有免疫调节作用，如活化巨噬细胞、提高MHCI类和II类分子的表达、促进抗原提呈等，在机体免疫控制和免疫病理中起着重要的作用。研究表明，外源性的IFN．Y既可以作为药剂用于感染性疾病或肿瘤等的治疗，又可以作为免疫佐剂，增强疫苗的免疫效果；内源性IFN—Y水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN-Y反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。对应，抗IFN．y的单克隆抗体(MeAb)作为研究、检测IFN．Y的手段，在免疫机制研究、免疫功能检测等领域具有广泛的应用。IFN-Y的免疫学检测0FN-y试验)是在特异性抗IFN-YMeAb的基础上建立的用于对样本中的IFN．Y进行定性定量分析的实验方法，己被广泛地用于基础研究和临床免疫学、疫苗免疫效果评估，器官移植、过敏反应以及胞内病原感染的诊断等。IFN．Y及其MeAb在畜牧兽医领域也有着广泛的应用。国外已有学者将基因重组牛[FN-Y(rBovIFN．y)及其McAb用于牛病的研究，抗原特异性的牛IFN．Y试验已在很多发达国家被用于多种牛疫病的检测，尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛，相关的研究也最为深入，国内这方面研究的报道比较少。最近几年来，随着基因克隆、重组、表达及单克隆技术的不断发展、成熟，通过基因工程手段制备rBovIFN．Y并在此基础上制备其MeAb成为可能。本实验克隆并表达BovIFN．Y，制备抗牛IFN．Y单克隆及多克隆抗体，建立可检测牛IFN-y的双抗体夹心间接ELISA方法。1．BovlFN．Y在大肠杆菌中的表达及其产物的鉴定通过PHA刺激，从全血培养上清提取BovIFN．vmRN&根据BovIFN．Y基因的已知序列设计引物，经过RT-PCR扩增出BovIFN．yeDNA，定向插入原核表达质粒pET-28a(+)，构建原核表达重组质粒，经测序确认，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，表达出大小在22kDa左右的蛋白；并对表达条件进行了优化．2．rBovlFN-YMeAb的制备与鉴定本研究以纯化的原核表达融合蛋白BovlFN．Y为免疫原，应用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出4株稳定分泌抗BovIFN-Y单克隆抗体的细胞株，分别命名为A7、A10，G6、G10，免疫球蛋白亚类鉴定都为igoI，腹水效价为l：29X100、l：2toX100、l：29X100、l：29X100，Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合22kDa的BovIFN-g，ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovIFN．y反应，而不与A985B、ESAT-6-CFP-10、GMCsF反应，表明4株单抗均为针对BovIFN．Y的特异性单抗。4 抗牛y．干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建证3．双抗体夹心间接ELISA方法建立选取单抗A10、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔酶标二抗，建立双抗夹心间接ELISA方法。检测BovlFN-Y。实验结果表明，此ELISA敏感性达到75ng／ml，特异良好，不与其它检测抗原不反应。此ELISA方法为建立牛IFN．Y实验检测方法奠定了基础。关键词：奶牛结核病；单克隆抗体；ELISA；BovlFN．Y 竺±奎些盔兰!堂笙堡!兰竺堡苎ABSTRCTIFN-YwasproducedmainlybyactivatedThlcells，CD8+cellsandNKcells．Besidesitsantiviralandantimmoractivity,IFN-7hasimmuneregulatingfunctions,suchastOactivatemacrophages,enchancetheexpressionofMHCIandMHCIImoleculars，andenhanceantigenprocessing．Therefore,IFN吖playsavitalroleiniminunecontrolandimmunopathology．ItWasreportedthatextrageneticIFN吖notonlyCanbeusedasamedicineintreatmentofinfectiousdiseaseandtumor,butalsoasavaccineadjuvanttOenhancetheeffectofvaccine．Atthemeantime,theamountofendogenousIFN-Tcouldreflectthecell．mediatedinlnlunefonctiontOsomeextent．Consequently,antigenspecificIFN-7responsecouldbeusedasanindexofthecell-mediatedimmunefunctionagainstspecificpathogens．Theimmuno-detectionofIFN-y，basedOnspecificanti-IFN-^rmonoclonalantibody,Wasaqualitativeand／orquantitativemethodtomeasureIFN吖iIlsamples．Thismethodhasbeenappliedtofundamentalrcsearch．，clinicalimmunology,vaccineevaluation,organtransplant,allergy,detectionofintracellularpathogeninfectionandso011．Meanwhile，IFN吖anditsmonoclonalantibodyalsohaveabroadapplicationinveterinarymedicine．SomeforeignscientistsreportedthatrecombinantbovineIFN吖(rBovlFN-r)anditsmonoclonalantibodyhavebeenusedfortheresearchofbovinediseases,andinmanydevelopedoontries,antigenspecificbovineIFN-，rassayhasbeenusedtOdetecteseveralinfectiousbovinedeseases，especiallyusedtodetectebovinemberculosis．Nevertheless,afewresearcheswerereportedinChina．ThisstudyclonedandexpressedrecombinantbovineIFN-3,，producedmonoclonalandmulticionalantibodiesagainstbovneIFN-％andestablishedasandwichindirectELISAtodetectbovineIFN吖．1．ExpressionandidentificationofBovlFN-7inEcoilBovlFN-TmRNAwasisolatedfromwholebloodculturemedianaafterstimulatedbyPHA．ThenBovlFNq,eDNAWasamplificatedbyRT-PCRusingBovIFN-^rspecificprimersandWasinsetedtoprokaryoticexpressionvectorpET-28a(+)．Aftersequencing，pETBovlFN-7WastransformedtocompetentEcoliBL21cells．A22kDaproteinwasexpressedafterIFrGtreatment，TheconcentrationofIPTGandthetimeofIPTGtreatmentweltoptimized．2．TheproductionandidentificationofrBovlFN吖McAbByusingpurifiedrecombinantBovlFN-7asantigenandlymphocytehybridomatechnique,fourhybridomastrainsweregeneratedtostablysvcretemonoclonalantibodiesagainstrBovlFN-％namedA7，A10,G6，G10，whoseimmunoglobinsubsetsWCTeall6 抗牛Y．干扰索单克隆抗体制备及ELISA方法榆测方法的建1zidentifiedasIgGl．Westem-blofinganalysissuggestedfourhybridomastrainscouldreacttO22kDarHis-BovlFN-yandformantigen-antibodycomplex．Dot-ELISAshowedthatfourhybridomastrainsonlyreactedtorHIS-BovlFN-T，butnotreactedtorHis-A985B，rHis．ESAT-6·CFP-10andGM-CSF,suggestingthatfourhybddomastrainsWer'erBovIFN-Tspecificmonodonaiantibodies．3EstablishmentofsandwichindirectELISAmethodAsandwichindirectELISAWaSestablishedbyusingA10monoclonalantibodyandpolyclonalantibodiesagainstBovlFN-y,HRPlabeledgoatanti-rabbitantibodyasthesecondantibody．Theresultindicateditsgoodspecificityandsensitivity．ThesensitivityWaS75ng／m1．andthereisnoreactiontootherantigens．neestablishmentofthesandwichindirectELISAtodetectBovIFNffsetthefoundationtodeveloplaboratorydetectionkitsforbovinetuberculosis．Keyword：Bovinetuberculosis，Monoclonalantibody,ELISA,BovlFN-T7 华中农业大学2006年颐十学位论文AmppguLAbAgbpBSADABDMSO，dNTP，DoCEDTAELISAghHRPIPTGKankDaLMcAbmgmInmLmmolODPAGEPBSr／rainSDSsecSKLTEMEDTMB缩略词(Abbreviation)amplicillinmicrogrammicrolitcrantibodyantigenbasepairbovinesermnalbium3，Y-diaminobenzidinehydrochloridedimethylsulfoxide．deoxyrinediaminetriphoshatedeoxycholicacidNaethylenediaminetetraaneticacidenzyme—linkedimmunosorbentassaygramhourhorseradishperoxidaseisopropylthio-B—D-galactasidekanamycinkilodaltonlitermonoclonalantibodiesmilligramminutemillilitermillimoleopticaldensitypolyacrylamidegelelectrophoresisphosphatebufferdsalinerotationperminutesodiumdodecylsulphatesecondN-lauroylsarcosinetetramethylethylenedamine3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine8氨苄青霉素微克微升抗体抗原碱基对牛血清白蛋白3，3'--氨基联苯胺二甲基弧砜脱氧核糖核苷三磷酸脱氧胆酸钠乙二胺四乙酸酶联免疫吸附试验克小时辣根过氧化物酶异丙基硫f}B．D-半乳糖苷卡那霉素千道尔顿升单克隆抗体毫克分钟毫升毫摩尔光密度聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液每分钟转速十二烷基磺酸钠秒十二烷基肌氨酸钠四甲基乙二胺四甲基联苯胺 抗牛Y．干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建屯第l章文献综述干扰素(Intcffcron,IFN)是一类具有高活性、多功能的诱生蛋白，具有广泛抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能。根据产生干扰素细胞来源、理化性质和生物学活性的差异，哺乳动物的干扰素分为5类，即d、B、t、u及Y。IFNoQ、IFN-13，IFN—o和IFN．t主要由白细胞、成纤维细胞和病毒感染的组织细胞产生，它们结合相同的受体，称为I型干扰素，其生物学效应以抗病毒、抗肿瘤作用为主，同时具有一定的免疫调节功能。IFN．Y主要由活化T细胞和NK细胞产生，其生物学作用以免疫调节为主。抗病毒作用较弱，被称为lI型干扰素。研究表明，内源性IFN．Y水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态，而抗原特异性的IFN．Y反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。IFN．y的免疫学检测(IFN—Y试验)是在特异性抗IFIN-Y单克隆抗体的基础上建立的用于对样本中的IF-N-Y进行定性定量分析的实验方法。IFN．Y试验一开始作为淋巴细胞增殖实验的替代试验出现，研究i正gqCHao，1986)，作为细胞免疫状态的重要指标，IFN-y试验比淋巴细胞增殖实验的特异性和灵敏度要高。与传统的用于IFN．Y检测的抗病毒活性分析方法(AVA)相比，建立在免疫反应基础上的IFN．Y试验的灵敏度和特异性更高(Van,1990)。目前，IFN．y试验已经广泛地用于研究基础和临床免疫学，疫苗免疫效果评估，器官移植，过敏反应以及多种胞内病原感染(尤其是结核病(Desem,1998))的诊断等。国外已经开始将抗原特异性IFN．Y试验用于多种动物疫病的检测(1iebana,1998；Palmer,2004)，尤其是牛结核的检测国内这方面研究的报道比较少。本文就结核病的历史及流行现状、结核病的诊断方法、抗原特异性IFN-Y试验的检测原理及应用以及在牛TB诊断中的应用等进行综述．1．1结核病的历史及流行现状结核病是伴随人类历史最长的疾病之一，是全世界由单一致病菌引致死亡最多的疾病。据资料介绍。自1882年柯霍发现结核菌以来，迄今因结核病死亡人数已达2亿人．1904年在德国出土的新石器时代(公元前5000-10000年)人的颈椎骨化石，被发现有结核病变的存在．18世纪结核病随着工业革命的兴起，在欧洲猖獗蔓延，大批病人死亡。20世纪40年代后，多种抗结核药物相继出现，结核病已成为可治之症，在上世纪80年代初认为在世纪末可以消灭结核病，世界许多地区的结核病防治系统被削弱甚至取消；HIV的流行而使结核病人迅速增加以及耐药性菌株的产生，使结核病的流行成为严重的公共卫生问题．1993年4月世界卫生组织提出“全球结核病紧急状态宣言”．世界卫生组织(WHO)估算全球有20亿入已受结核杆菌感染，每年有约6500万人受到结核病感染，全球结核病发病率每年平均增加O．4％。同时，结核病是一种是人畜共患病，也是世界动物卫生组织(0IE)规定必须强制报9 华中农业大学2006年硕七学位论文告的疫病。牛结核病(bovinetuberculosis)是由牛型结核分支杆菌(mycobacteriumbovis)或结核分支杆菌(Mytuberculosis)所引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病。该病宿主众多，几乎可以感染所有的温血动物，并可通过病畜传染给人类。牛结核病的传染流行可造成奶牛乳房炎、肺结核、结核性胸膜炎、肠结核等疾病，导致奶牛产乳率下降，不仅严重影响畜牧业的健康发展，而且严重威胁着人类的身心健康。受结核菌污染的乳制品和肉制品对食品安全构成了严重威胁，结核菌在牛群中的传播和流行直接影响着畜牧业的持续发展和人类的健康，世界卫生组织曾表示：除非消灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会取得成功。1．1．1病原结核分枝杆菌纤细，中等大小，无芽孢。无荚膜，无鞭毛。人型结核分枝杆菌．细长有分枝，牛型结核分枝杆菌较短粗，禽型结核分枝杆菌较短小而呈多种类型。革兰氏染色阳性，有抗酸性染色特征。对干燥和消毒药的抵抗力很强。5％来苏儿或石炭酸经24h才能将其杀死，牛奶中的结核杆菌65"C加热30rain死亡。日光照射30．120min死亡。^图1-1结核分枝杆菌基因图谱Fig．1-1CircularmapofthechromosomeofM．tuberculosisH37Rv．1．1．2发病症状结核病的潜伏期不一，一般为10-15d，长者数月甚至数年不等。发病动物精神和健康状况逐步恶化，呈渐进性消瘦。常见的多为肺结核，病理表现为食欲不振，咳嗽，呼吸困难，被毛粗乱无光．乳房结核时泌乳减少或停止，乳房中形成肿块，严重者乳腺萎缩或肿大变硬．肠结核时便秘与腹泻交替出现，食欲不振，消化不良，迅速消瘦。淋巴结结核时表现为淋巴结高度肿大，硬而凹凸不平．生殖器官结核时 抗，rr．干扰寨荦竞绪抗体制蔷及ELISA方法检测方法的建电常见性机能紊乱。性欲亢进或减退。母牛发情频繁但屡配不孕，或孕后流产l公牛睾丸肿大，阴茎发生结节糜烂。脑结核时常伴有癫痫，运动障碍，感觉过敏等．粟粒性结核也叫“珍珠病”，即全身布满结核，直肠检查可摸到腹膜发生结核。此外还有骨、关节、皮肤等结核，可见局部硬肿变形。本病发展到后期，病牛形体消瘦，问歇性发热，不久衰竭死亡。有的病例园局部病灶崩溃，大量结核菌侵入血液而转为急性，全身组织、内脏出现无数栗粒大的结节，高热不退，经10-20d死亡。1．1．3流行现状结核病(TB)是最古老的疾病之一，一直威胁着人类和动物的健康，造成了巨大的损失。自从卡介苗(BCG)的推广以来，TB的发病率一度有所下降。但自上世纪束期，由于耐药菌株的出现，艾滋病，以及吸毒、贫困、国际旅游、难民迁徙等多种原因，该病的发病率又渐呈上升趋势。结核病是一个全球性的严重的公共卫生问题，据世界卫生组织估算，全球有近20亿人感染结核菌，有近2000万人患有结核病，每年新发肺结核约800万．1000万，目Iii『结核病已经成为传染病的头号杀手，超过艾滋病、疟疾、腹泻、热带病死亡人数的总和，平均每15秒就有一个人因TB而死亡fDolin,1994)。在发达国家，约有2，3的新发现TB病例为HIV共感染患者(WHO，2000)。图1-2结核病的全球分布0003)Figure1-2TubereuloslaDistributingmapin2003我国是结核病高负担国家之一，当前，我国患病人数居世界第二，全国约有5．5亿人感染结核菌，有肺结核病人450万，每年还有新生肺结核病人145万人，由于贫困，人口增多，流动人口增多、多耐药结核病增多以及艾滋病的流行，使结核病问题更加严峻。．上世纪50年代．我国结核病患病率高达5000／10万，死亡率为300，10万，自60年代开始下降。我国曾于1979年、1984／1985年、1990年和2000年先后四次进行了全国结核病流行病学抽样调查，结果显示结核病仍是严重威胁。全国每年约有13万人死于结核病，结核病死亡顺位虽已降至第9位，但结核病死亡仍是各种传染病和寄生虫病死亡总和的2倍．在肺结核死因中，咯血、病变急剧进展仍占很大的比例， 华中农业大学2006年硕士学位论文说明目前结核病人的病情仍然很重，而在肺结核死亡病人中有21．6％的人未接受抗结核治疗，有83．8％的人从未进行结核病登记。在卫生部2005年公布的国内传染病疫情报告中，肺结核的发病数及其导致的死亡人数是传染病最多的．现进一步贯彻和加强TB控制己是刻不容缓。结核菌感染机体后，大多被机体的免疫防御系统限制在局部，表现为结核菌的潜伏感染(LTBI)，通常不表现任何症状，胸透检查无异常。在这些LTBI患者中，将有10％左右的患者由于潜伏在体内的结核菌的重新活化而发病(卫生部，2005；Jasmer,2002；Tufariello，2003)。由于LTBI使结核病的扩散更广，而且在疾病发展到一定程度以前不易发觉和控制。这种情况更加剧了结核病发现和控制的困难。牛结核病(Bovinetuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobecteriumbovis)和结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)所引起的一种人畜共患的慢性消耗性传染病。结核⋯杆菌对外界的抵抗能力较强，而且当健康人和畜禽接触病人和病畜呼吸、咳嗽或打喷嚏时呼出或喷出大量带有结核菌的气体、飞沫，食用未经消毒的结核病牛的肉或乳及病畜粪便、尿及其他分泌物污染物体、食物和环境都可被感染。因此牛结核严重的影响畜牧业持续健康的发展和直接威胁人的身体健康，是世界动物卫生组织(OIE)规定必须强制报告的疫病。受结核菌污染的乳制品和肉制品对食品安全构成了严重威胁，结核菌在牛群中的传播和流行直接影响着畜牧业的持续发展和人类的健康，对牛群及时进行检疫并扑杀病牛业已成为TB控制中的重要环节．在世界范围内，美国是最早实行根除牛结核病的国家。自1917年实施消灭牛结核病的计划以来，已经使发病率降低为0A8％：而在欧共体国家，丹麦、德国及比利时等已经基本消灭了牛结核，英国和法国处在控制状态，而西班牙的牛结核发病率为10％。第三世界国家牛结核高度流行，在墨西哥、巴西及南非等国家都有相关报道。由于其它动物及人类结核病的发生和流行，各国都在不断的检疫和高度警惕。1．2结核病的诊断方法目前，国内外用于诊断牛结核病的检验方法大体上可分为三类：第一类是病理检测方法，如细菌培养、剖检，第二类是细菌学检验方法，如涂片镜检、细菌培养和动物接种等；第三类为采用分子生物学检验方法，如生物探针法；第四类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、ELISA和IFN．Y试验等．1．2．1病理检测方法结核病特征性病变是形成结核结节，从针头大到鸡蛋大不等，呈白色或黄色，切开后中心有干酪样坏死物，且常伴发钙化。增生性结核结节的中心为灰白色或黄色的干酪样坏死或钙化，外有肉牙组织包绕。渗出性结核结节为纤维素性渗出物浸润组织，形成干酪样坏死，切面呈灰白红色与灰白黄色交织的斑纹．肺结核时常见有千酪样变性的病灶或肺内的空洞，其中有黄色于酪样或脓样的内容物，并伴发胸 抗牛Y．干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建它膜炎和心包炎。当支气管患病时，可在支气管内部发现结节，继而变为溃疡。支气管淋巴结常肿大，有时可达拳头大小或更大，断面见有结核性干酪样变性的病灶，常发生钙化．胸膜腔浆膜结核时，在浆膜上形成很多密集的小结节，同时结缔组织增生。肠结核时，在粘膜上发生小结节，坏死崩溃后在结节中央发生溃疡。1．2．2细菌学检验方法涂片镜检和培养是经典的细菌学检测方法，是结核病诊断治疗及评价治疗效果最可靠的标准。而且在有微生物的实验室均可开展。但涂片法敏感性差，平均检出率只有25*／,-35％，无法区分死菌与活菌。培养法周期太长，约4．8周，且影响因素很多，不易标准化，不能满足临床应用．1．2．3PCR近年来，以PCR法为代表的基因诊断技术作为结核病非培养技术快速诊断是一项重大突破。PCR的方法快捷，在菌体微量的情况下也可以检测出来，而且特异性比较高。经典的PCR法是一对引物，3个温度，虽然它快速灵敏，但由于污染严重、扩。增抑制物的存在、试剂盒缺乏规范化及标准化等因素影响PCR结果的可信性．为此国内外学者不断开发新的高敏感性和特异性的PCR方法．比如聚合酶链反应一增强化学发光法(PCR-ECL)，PCR-微孔板杂交技术等。二1。2．4免疫学方法结核菌素皮内试验(TST)是目前应用最广泛诊断结核病的主要检测手段之一．早在1890年就被提出，是目前仍在使用的最古老的诊断试验(Styblo，1980)。TST的原理：以结核菌纯化蛋白衍生物(PPD)作为刺激物，检测机体针对PPD的以细胞免疫为基础的迟发型超敏反应．但PPD是一种粗制抗原的混合物，其中很多成份为多种非结核分支杆菌(fOrM)及被BCG所共有，所以TST的特异性较低。而在由于AIDS或者其他能够导致免疫抑制的原因、TB晚期、营养不良等导致免疫低下的个体中，迟发型超敏反应不明显，TST的灵敏度降低．由于免疫无反应的存在，在糖尿病、慢性器官功能衰竭以及接受免疫抑制治疗的个体中，TST并不适用。此外，TST的操作和结果判断容易掺杂操作者的主观因素，而且TST试验的结果观察需要对患者进行二次观测，即使针对同一次试验，不同的人可能会得到不同的结果。而且做一次TST试验相当于一次微量免疫，将会对接受检测的个体的抗结核T细胞免疫反应产生影响，临床上曾有因注射PPD而导致的过敏性休克的报道(Huebner,1993)．最近，很多学者对外周血T淋巴细胞对结核菌特异性抗原的IFN．Y反应在结核病诊断中的应用进行了研究。结果表明，抗原特异性ⅡN．Y试验与TST相比具有很多优点(1ee，2002；Andersen,2000；Barnes，2004；Lalvani，2003)：由于抗原特异性IFN—Y试验是体外试验，检测过程不受外界环境影响，结果判断的主观性较小，整个检测过程只需和被检测者接触一次．以特异性抗原为检测抗原的抗原特异性gUN-Y试验被 华中农业大学2006年硕士学位论文认为比以PPD为检测抗原的TST试验具有更高的特异性。日d口抗原特异性IFN．y试验已经被应用于多个领域如；诊断活动性结核病、鉴别诊断结核菌的感染、作为机体保护性免疫的一个相关指标或者疫苗免疫效果的评价指标，对治疗效果进行监测等。1．2．5其它方法随着检测技术的发展，有许多新的检测结核的方法得到了发展和应用。比如压电基因传感器芯片法检测结核杆菌DNA，压电基因传感器芯片技术主要依据晶体液相振荡理论，运用压电传感器基因芯片技术结合，对标本中靶基因进行检测。此技术检测结核杆菌较PCR法检出率略高。用于检测的DNA探针是人型结核杆菌的插入序列IS6100的一段DNA，由于IS6100只存在于结核分支杆菌复合群，因此该探针具有群特异性．结核分支杆菌噬菌体Phage88，应用重组的表达荧光素酶的结核分支杆菌噬菌体Phage98，采用生物发光方法建立起一种简便快速检测结核杆菌活力和耐药性的方法。噬菌体生物发光技术是检测活的噬菌体在活菌体内增殖后所表达的荧光素酶的含量，通过检测发光的强度就可对噬菌体进行定性和定量分析。从而定性或定量的分析相应的分支杆菌存活及其数量。3、抗原特异性IFN-Y试验3．1试验原理抗原特异性IFN-Y试验是一种体外T细胞免疫检测试验，被认为是有望替代TST的体外检测试验。IFN-Y试验的原理是：抗原致敏的T淋巴细胞，在再次遇到相同抗原时，将在短时间内产生IFN-Y，通过检测产生的IFN．y含量，即可确定被检动物是否感染了相应的病原。因此，如果用结核分枝杆菌特异性抗原作为刺激物，如果产生高水平的IFN．y即可表明有结核菌感染存在．一开始，研究者在抗原特异性IFN-Y试验中主要以PPD为刺激抗原，后来研究者开始尝试使用结核分支杆菌特异性的抗原，象ESAT-6、CFP．10等。与PPD相比，以特异性抗原作为检测抗原的抗原特异性IFN-Y试验具有更高的特异性，在一些方面具有很高应用价值。3．2．抗原特异性IFN-Y试验的应用由于结核病大多数情况下是以LTBI的方式存在，对于结核病早期的发现的防治十分的重要。由于活动性TB患者受到疾病本身的免疫抑制的影响，使得外周血的IFN-Y水平下降，因此，在理论上，抗原特异性IFN．Y试验在结核隐性感染(LTBI)中的灵敏度要高于(至少不会低于)活动性TB(Vekemans,2001)．在发达国家的低LTBI风险人群中进行的抗原特异性IFN-Y试验的特异性研究表明，使用ESAT-6／CFP．10两种抗原且过夜培养的检测特异性达14 抗牛Y．十扰索单克隆抗体制备及ELISA方法检测方法的建盘890／,-100％(Brock,2004；Chapman．2002；Ewer,2003)。在接受过BCG免疫的个体中，抗原特异性IF．Y试验的特异性远高于TST，分别为89％．94％和53％．55％(Broek,2004；Munk,2001)。由于缺乏结核病检测的金标准，学者把受检者与结核病人近距离接触的时间作为LTBI的一个金标准的代用指标。Ewer等(2003)进行了大规模的研究，结果发现，受检者同结核病人的接触时间及空间距离的相关程度的比较上，抗原特异性IFN-Y试验比TST高的多，抗原特异性IFN．Y试验检测灵敏度较高。同时抗原特异性IFN·Y试验不受BCG免疫状念的影响，其特异性高于TST。IFN．Y实验的较高的特异性将有助于低流行国家对LTBI进行更加精确的诊断并对检出个体及时进行针对性的抗结核治疗，减少耐药性结核分枝杆菌的传播及控制抗生素的滥用。在TsT检测时。与环境中的非致病分支杆菌感染病人接触较多的受检者中也存在阳性反应(Arend，2002)。TST阳性的受检者中，有相当大一部份是由M．avium引起的(Hersh,2003；VonReyn，2001)。有研究表明，在确诊的M．avium感染中，抗原特异性IFN．Y试验结果始终阴性(Lein,1999)，可见在环境存在非致病分支杆菌的干扰时，抗原特异性IFN-Y试验仍然具有较高的特异性。1通过抗原特异性IFN．Y试验，可以得出LTBI的流行情况，如印度Mumbai地区的感染率为80*／0(Lalvani，2001)，冈比亚的感染率为30％(Hill,2004)。另外有研究表明，以ESAT-6作为检测抗原，可以根据抗原特异性IFN-Y试验的结果对LTBI是否会发展成为活动性TB进行预测，而如果将ESAT-6换为PPD则不能进行这样的预测(Doherty,2002)。尽管TST存在原理及实际应用的不足之处，但作为一种应用广泛的通用检测方法，通过TsT诊断出LTBI并对检出者进行相应治疗，确实大大降低了活动性结核病的发病率①吡t，1982)。对根据抗原特异性IFN．Y试验结果诊断为LTBI的病人进行治疗，在目前严峻和复杂的结核病流行趋势下，将为进一步降低TB的临床发病率提供有力的支持。伴随HW在全球迅速蔓延，HW-TB感染者也越来越多。HW-TB共感染患者中，HIV-TB共感染患者的生存年限显著缩短(Whalen．1995；Dheda,2004；Munsiff,1998)。对HIV阳性的LTBI患者及时发现及进行抗结核治疗，可以大大降低发展成为活动性TB的风险，延长HIV-TB共感染患者的生存年限。但是，由于在HIV感染以及其他存在免疫功能低下的患者中存在的免疫无反应性，限制了TST在这些情况下的应用(Huebner,1993)。Chapman等(2002)对39个赞比亚的共感染HIV-TB且存在高度免疫抑制的患者进行了研究，结果表明，在活动性TB患者中的灵敏度为90*,4，同时发现有14个患有LTBI的成人，他们的抗原特异性IFN-Y试验阳性而TST阴性．可见，在HIV阳性的LTBI患者中，抗原特异性IFN．Y试验的灵敏度可能高于TST。但是，TST阴性而IFN．Y阳性的患者并没有表现出较高的发展为活动性TB的风险(Daley,1998；Gordin,1997)，因此，抗原特异性IFN．Y试验在HIV-LTBI共感染患者 华中农业大学2006年碗十学位论文中的确切的应用效果，以及免疫无反应对IFN．Y结果的影响程度有待于进一步考证。抗原特异性IFN．Y试验可以用于检测抗结核治疗的效果。根据抗原特异性IFN—y试验的试验原理，在体内环境下，最近接触过TB特异性抗原的效应淋巴细胞再次遇到相同的抗原时，只需数小时即可产生IFN-Y。与效应淋巴细胞不同的是，记忆T淋巴细胞往往需要几天时问才能生成IFN．Y(Kaech,2004；Rocha．2002)。因此，如果在检测中全血或PBMC的培养时问为24小时或者更短的时间(1"-SPOTTB：16．20小时；QuantiFERON-TBGold：16-24小时)，检测的主要是效应淋巴细胞产生的IFN-Y，而不是由记忆T淋巴细胞所产生。而如果延长培养时问，则检测的将主要是记忆T细胞产生的IFN．Y，这可能使得经过治疗或者感染已被清除的患者产生阳性结果。如果采用短时间培养(≤40小时)的研究，在接受治疗后，IFN．Y反应显著降低(Pathan,2001；Carrara,2004)，如采用较长时间培养(3．6天)的研究，在接受治疗后IFN-Y反应没有变化或者增强(Attiyah,2003；Ravn,1999；Ulrichs，2000；WuHsieh，2001)。Carrara等(2004)的研究显示，IFN．Y试验阳性的病人，在经过3个月的治疗后，将转为阴性；而那些始终表现为阳性的病人，病情往往没有得到好转，还停留在活动期。因此，抗原特异性IFN-Y试验可以用来作为TB病人病情发展及治疗效果的进行评价。结核病最主要的病区是发展中国家，比如印度和中国。在发展中国家，虽然人口中患有LTBl的人占了较大的比重，但其中最后发展成为活动性TB的比例不到5％(Falk，1978)，由于经济原因，首先需要对活动性TB人群进行医治。但在这些地区进行的TST结果往往更不可靠。在很多发展中国家，人们往往一出生就接受BCG免疫，这使得TST假阳性的比率上升2倍以上(Wang，2002)．这些地区通常存在大量的环境中的非致病分支杆菌，也会大大增加TST假阳性的比率上升。在发展中国家，IFN．Y试验将主要应用于以下几个方面：(1)用于流行病学调查，精确确定一个社区中LTBI的流行情况。(2)用于诊断HIV阳性病人感染的TB，在很多发展中国家，感染了HIV的病人还不能方便地得到高效的抗反转录病毒治疗，通过这种方法能够在没有接受抗反转录病毒治疗的情况下降低HIV的发病率．(3)用于营养不良TB患者的诊断，营养不良是激活LTBI的一个潜在的风险因素．对于这部分人群，TST经常表现为无反应．初步的研究表明，抗原特异性IFN-y试验有望解决这个问题。对营养不良儿章进行的比较研究显示，IFN．Y的ELISPOT试验的阳性率(78％)比TST(44％)的阳性率高的多(Temmerman，2004)。(4)用于诊断儿章TB，在发展中国家，儿童在TB人群中占有很大的比例。儿童一旦接触了传染源，TB的感染率会很高(Marais，2004)。TST在这些疾病中的灵敏度和特异性很低，而抗原特异性IFN-Y试验可以在这些人群中发挥重要的作用。 抗牛Y．干扰索单克隆抗体制备及ELISA方法榆测方法的建芷3．3．新型TB特异性抗原在抗原特异性IFN-Y试验中的应用由于早期的IFN-Y试验主要以PPD作为刺激抗原，而PPD是一种粗提取产物，对于试验特异性有很大影响。IFN．Y试验可以通过研究和制备新型检测抗原进行改进，以便适应不同的应用需求。例如，以ESAT-6和CFP．10作为检测抗原，可以区分是卡介苗免疫还有野毒感染，作为检疫重要的指标。如果能够对原有试剂的组分加以改进，补充某种检测抗原，该抗原在一种人群中能够激发IFN-Y反应，而在另一种人群中没有这种反应，如此改进后的抗原特异性IFN-Y试验将具有更大的应用价值。肝素结合血凝素(HBHA)HBHA参与M．tubeTculosis和肺上皮细胞(而不是巨噬细胞1的结合过程，是M．tuberculosis进行传染的必要成分，HBHA缺陷将导致结核菌无法扩散(Pethe，2001)。有学者发现，来自M．tuberculosis潜伏感染患者的淋巴细胞能够对HBHA产生反应并分泌IFN．Y，而来自活动性TB病人的细胞则没有此种反应(Temmerman，2004)。经多年研究，目前有2种应用广泛的商品化IF'N-Y检测试剂盒，即TSPOTTBassay(OxfordImmunotee,Oxford,UK)和QuantiFERON-TBGold(CellestisLimited．Victoria，Australia)．这2种装试剂盒都是检测ESAT-6和CFP．10多肽与淋巴细胞过夜培养后的IFN．Y反应，不同在于：TSPOTTB用得是ELISPOT方法，检测样本是外周血单核细胞(PBMC)，该方法已经得到欧盟CEMark的批准；QantiFERON·TBGold以ELISA方法为基础，以全血作为检测样本，已经得到了欧盟的CEMark和美国的FDA的双重认可。QuaatiFERON-TBGold的早期产品以PPD为检测抗原，现在已经被最新的QuantiFERON-TBGold所取代。通过选择结核分枝杆菌的特异性抗原及结核病免疫过程中相关因子，可以进一步增加检测结果的特异性及敏感性，拓展抗原特异性ⅡN．Y试验的应用领域。3．4．IFN-Y试验在牛TB诊断中的应用奶牛结核病，与布鲁氏菌病并称奶牛的“两病”，历来是严重威胁奶业的健康发展的重大传染病。其病原为牛分支杆菌，可感染奶牛及其他包括人在内的几十种温血动物，尤以奶牛最易感染，牛分支杆菌可通过空气，饲料，垫料，粪便等在动物间传染及感染饲养人员，也可通过未严格消毒的带菌牛奶及奶酪等奶制品感染饮食用者。结核病为慢性消耗性疾病，感染牛分支杆菌的奶牛并不一定马上出现临床症状，因此易被忽视，但奶牛通常会在一定时间后发展出临床症状，并将病菌传播给群内其他动物。如果不重视，不早检测、早隔离或淘汰，易造成牛群高比例感染，感染牛日渐消瘦，产奶量降低，降低奶牛的经济价值，缩短奶牛可使用期，而且成为人结核病的传染源。通过吸入含菌气溶胶或食用受污染的乳制品等，牛分枝杆菌从牛传染到人(Wedlock，2002)，其传播和流行影响着畜牧业的持续发展和人类的健康。在西方17 华中农业大学2006年硕士学位论文一些畜牧业发达家，经过实施“检疫一扑杀”措施，疫情有所控制。但是在某些地区(如英国)，由于自然界中存在多种该病的野生动物贮存宿主，牛群中的TB疫情近年来又有所抬头。在拉丁美洲、加勒比海、非洲、亚洲等一些不发达的地区，由于没有贯彻实施相关的控制措施，牛群中的TB疫情正呈现愈渐蔓延的趋势。随着我国人民生活水平的不断提高，人们对健康生活的要求也迅速提高，与之相一致的是乳制品需求量的急速攀升，随之带动了奶牛业在近几年的迅猛发展。’在这样一种情况下，我国的牛TB疫情正在受到日益广泛而密切的关注。1985，1987年进行的两次全国奶牛抽样调查结果，牛TB患病率分别为5．83％与5．43％．1979，1985，1990年三次全国TB流行病学调查显示，由M．boris导致的TB所占的比例分别为3．8％，4．2％，6．4％(徐美英，1998)。此后未有全国性的调查统计数据见诸报道，然而地方性的疫情调查显示情况也很严重(黄纪锉，2000；郭海晏，2002；朱长光，1999)。一。一感染牛型结核主要有以下途径：(1)呼吸道：患结核病的牛咳嗽时，可将带菌飞沫排于空气中，健康人和牛吸入，即可引起感染。大部分是在肺部发病。在大自然环境中放牧野生牛结核病，患病率l％．5％。而圈养的奶牛和鹿由于通风差，互相密切接触，结核感染率可高达25％．50％。(2)消化道：饮用牛结核菌污染的牛奶、未经消毒或消毒不合理，皆可引起人和动物发病．儿童饮用污染牛结核菌的奶，可在咽部或肠部发病，也可引起咽部及锁骨上浅表淋巴结炎，或在肠道引起肠系膜淋巴结炎。至今牛结核病造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出；“除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制是不会成功的”。牛结核许多来源于野生动物。我国牧区地域辽阔，那里几乎家家户户饲养牛，近年来城市家庭中喂养狗、猫等宠物也日渐增多。这些动物也可在人群间传播结核茵。Wood等(1990)首先将抗原特异性的IFN．Y试验应用于牛TB的检测。在西方国家得到普遍应用的是ELISA方法(Ng，1997)。该测定系统简便、快速，便于用作疫情监测时大量样品的测试。以PPD作为抗原，该法灵敏度约为89．3％，特异性约为92．2％。若以ESAT-6作为刺激抗原，虽然灵敏度有所下降(约76．3％，其损失的一部分灵敏度原本就是由PPD交叉反应所导致的假阳性、，但是特异性可99．2％(Pollock，2000)。2001年，Vordermeier等(Vordermeier，2001)报道，通过使用混合了ESAT-6和CFP-10的。鸡尾酒”抗原进行刺激，可使该试验的特异性达到100％。另据Ryan等(2000)报道，在TST进行后的8．28天内再进行IFN．g试验，其灵敏度和特异性未有显著影响(分别为85％和93％)，因此可以作为TST理想的补充试验。最近的研究发现，用ESAT-6作为刺激抗原，可以大大减少交叉反应，从而显著提高该方法的特异性．使用BCG对牛群进行免疫接种并不会影响对疫情的监测，因此能够并行实施疫情监测计划和免疫接种计划，所以该方法尤其适用于那些对牛群进行BCG接种的国家或地区．诊断上的高特异性将大大降低大规模实施“检18 抗叶二Y．干扰索单克降抗体制备及ELISA方法榆测方法的建证疫一扑杀”计划的经济成本，从而有利于这一计划的大范围推广实施。此外，有证据表明，ESAT-6是M．bovis感染早期的一种优势抗原，使用该抗原有助于早期诊断牛TB。澳大利亚的CSIRO和CSL合作攻关，于1989年率先退出商品化的套装检测试剂Bovigam，并于1991年被澳大利亚政府指定为牛TB根除计划的大规模筛选试验。在此基础上，澳大利亚经过6年的努力，己于1997年12月宣布消灭了牛TB。迄今为之，除澳大利亚以外，牛IFN．Y试验的大范围田闻试验已在世界上许多国家(包括爱尔兰、比利时、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利爱尔兰和新西兰等)逐步开展。·1．4．展望抗原特异性IFN-y试验是TB的诊断新的方法，该试验在BCG免疫患者以及由于环境中的非致病分支杆菌导致的TST假阳性的个体中，同样具有很高的特异性和灵敏度。实践证明，抗原特异性IFN-Y试验极大地提高了临床上TB实验室诊断的可靠性，为人群的TB控制计划及牛群的“检疫一扑杀”计划的实施提供了强有力的技术手段，具有极大的社会效益和经济效益。对牛TB的检测中能否完全替代TST等，值得人们进一步研究和关注。国内及本实验室把已有学者对用基因工程技术表达ESAT-6和CFP．10等TB特异性抗原进行了研究(刘林，2004；师长宏，2004：陈全，2004)．随着新型TB特异性抗原的发现和使用，必将进一步改善和提高抗原特异性IFN-Y试验的特异性和灵敏度，推动抗原特异性IFN．Y试验在TB控制中的临床应用。为我国结核病的防控提供有力武器。19 华中农业大学2006年硬十学位论文第2章牛IFN．y基因的克隆及表达2．1研究目的和意义Y．干扰素(IFN-Y)又称II型干扰素，是一种由CD4+ThI型、CD8+T细胞以及NK细胞产生的细胞因子。它不仅具有I型干扰素的抗病毒和抗肿瘤活性，更重要的是它还具有促进MHCⅡ类抗原表达、增强APC细胞与T细胞的相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒T细胞产生的能力等诸多免疫调节活性，不仅能应用于一些疾病的防治，而且可作为免疫佐剂。Cerretti等(1986)首先克隆出BovlFN．Y基因后，国外学者在利用基因工程技术生产重组牛IFN-Y的研究也开始兴起，先后在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞等中表达出了rBovlFN．y，并对其免疫学和生物学活性进行了一些研究。本研究从奶牛外周血淋巴细胞中提取了BovlFN．YmRNA，RT-PCR克隆了BovlFN-YeDNA基因，构建原核表达的重组质粒，并进行了序列分析。经过IPTG诱导表达，得到有活性的BovlFN．Y蛋白，为抗BovlFN．Y单克隆抗体的深入研究及应用奠定基础。2．2材料与方法2．2．1材料2．2．1．1质粒及菌株克隆载体pMDl8-T购自TaKaRa公司，质粒的限制性图谱如图2．1；原核表达载体pET-28a为Novagen公司产品，质粒的限制性图谱如图2．2。大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)均由本实验室保存提供，牛全血由华中农业大学试验牛场提供。2．2．1．2主要药品及试剂PCR所用的酶EXTaqDNApolymerase、各限制性内切酶及工具酶均为TaKaRa公司产品。DNA回收试剂盒为上海生工生物工程公司产品。胰蛋白胨、酵母浸出粉购自Oxoid公司，TSB(Tryptiesoybroth)、TSA(Trypticsoyagar)培养基购自Difeo公司。氨苄青霉素、卡那霉素、Tris碱、十二烷基磺酸钠、丙烯酰胺及、N，N’．亚甲双丙烯酰胺和3，3'--"I甲基联苯氨为Amlrcse,o公司产品。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG为SouthernBioteehnologyAssociation(SBA)公司产品．其它各类试剂均为国产分析纯．2．2．1．3抗生素的配制氨苄青霉素舢lp)：用无菌水配成贮存浓度50mg／mL，过滤分装，．2012备用。卡那霉素(Kan)-用无菌水配成贮存浓度25mg／mL，过滤分装，．20"C备用 抗牛Y．干扰索单克隆抗体制各及ELISA方法捡测方法的建屯图2-1pMDIS-T载体限制性图谱。Fig．2-1Restrieth,emapofpMDlS-Tvector2．2．1．4细菌培养基的配制LB液体培养基(低盐)：胰蛋白胨109，酵母浸出粉59，NaCI59，溶于950mL蒸馏水中，调pH值至7．o．7．2，定容至1000mL．高压灭菌后备用。LB固体培养基(低盐)；按上述方法配制液体培养基，每100mL加1．59琼脂粉，高压灭菌后，等温度降至50℃左右，加入相应的抗生素后，铺制平皿，待培养基凝固后，将制好的平皿放4"C冰箱保存。TSB、TSA培养基按照使用说明配制。2．2．1．5质粒抽提与鉴定试剂的配制溶液I：50mmol／L葡萄糖，10mmol／LEDTA,25mmol／LTris-ClOH8．o)，高压蒸气灭菌20min，置4"C保存备用。溶液n(新鲜配制)：0．2mol／LNaOH,1％SDS。溶液llI：3mol／LKAC。冰醋酸调至4．8。50xTAE缓冲液：Tris碱2429加入到700mLddH20中，再加入冰醋酸5．7mL，O．5mol／LEDTA(pH8．O)100mL，用ddH20定容至1000mL，室温保存备用．O．8％琼脂糖凝胶：2mL50xTAE缓冲液，98mLddH20，琼脂糖0．89，加热溶解。7．5mol／L醋酸铵(NH4Ac)溶液：57．89NH4Ac溶于少量ddH20，定容至100mL．TE缓冲液(pH8．O)；lmmol／LEDTA(pH8．O)，10mmoFLTris—CI(pH8．O)。酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)；用吸管分别吸取饱和酚25mL、氯仿24mL和异戊醇lmL，送入到已装有适量TE(pH8．O)的棕色瓶底部，轻轻混匀。氯仿：异戊醇(24：1)：氯仿48mL'异戊醇2mL，TIE(pH8．O)覆盖，储存于棕色瓶备用。21 华中农业大学2006年颂十学位论文，E他8卅+)Wctors—————————————兰兰卫L—TIrpt．T舶“·’咖⋯H·n_MI¨t棚帅．nlm,TT·r雄‘rt_-h·¨--ⅢPh'一radI玳Ap-¨3●“呻№·■l·n州r‘．JIh．I蝴_-忡住^¨I‘■-■_、“、hm⋯dwirl■·¨R#㈣kh·¨一r捌JE"蚺拥hsl"4州时b“·I山帆tImfhPtⅢH越删‘‘q．雏●h盯州te’嘲’·r·御·hm竹刊itfJillpr·魏埘执“目m3rlp··hrr¨^llmt■·●-带‘砷“嘲_”一MI¨l"-I“暇帅“·r⋯"hd¨t7‘^A¨机懈hu■肼w¨■啪1h¨‘Hq“Ⅷ州‘q_·tImhlk·-’IH●Ihr¨M¨■埔”¨Im““r'ln⋯I■dlliI■qI●扣■n●¨HIIJhA加t⋯t’P■“'¨·h¨t-'口岫Idfl■tImm州r■谢d叫M1●Ifmllql-^“-●¨Il●州ltm¨U¨H¨_f，咖-I_I¨r朋-rr“J●No．O．007矩■t·舢■’州*¨h-hT7⋯lⅣl^t瑚％"ii．f～rt■tⅢqⅢm¨tpTJF【“¨q"4一时目na口r?ot担“Ⅲ●q“●I—衄砷7Z嚣¨¨Il^‘h■●■q雌,／／an口IIj抽l’I硼梯Ⅲprj口t‘““q鲋忡R“l柚I玎”咖nh■叶∞佗“^Im镕Ⅷw∞m¨≈lm¨“ⅧⅡ34b#dnm■qwm”5m7|j‘■≈hⅢ5J4T椰m1一hr旷T2砷f}’3“p阿2即I’w●●I’mhpFIMt，‘mM％Ⅷ”●Il_h_k*●哪m‘咐mp|r荔H¨b4sIM坤一心，^tⅧhIH‘●●hjh哪1．*bqph乍_Ⅱm，“II■l埘I^r2盱rtJh4湖bp纠．N·●＆ⅥhH“却m_F甜h■■IxⅧ“拙1月ⅢJ■l憾．图2-2质粒pET-28a限制性图谱Fig．2-2RestrictivemapofplasmidpET-28a2．2．1．6包涵体提取用缓冲液的配制缓冲液A：50mmol／LTris-HCl，0．5mmol／LEDTA，50mmol／LNaCI，5％甘油，O．5mmol／LDTT(即加即用)．生理盐水：8．59NaCI．1000mLddH20。TE(pH8．O)：10mmol／LTris-HCl，0．5mmol／LEDTA．2．2．1．7SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS．PAGE)缓冲液的配制 抗牛Y．干扰素甲克降抗体制各及ELISA方法捡测方法的建立5×Tfis一甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱7．559，甘氨酸(电泳级，pH8．3)479，25mL10％SDS(电泳级)，加ddH20溶解定容至500mL。30％聚丙烯酰胺母液：将299丙烯酰胺及lgN，N'-亚甲双丙烯酰胺溶于60mLddH20中，加热至37℃溶解，定容至100mL，4"C避光保存备用。1．SmoULTris—Ci(pH8．8)：Tris碱36．339溶于ddH20中，调pH值至8．8，定容至200mL．1．0mol／LTris-Cl(pH6．8)：Tris碱24．229溶于ddH20中，调p8值至6．8，定容至200mL。10％过硫酸铵：O．59过硫酸铵溶于5mLddH20中，4"C保存。10％SDS聚丙烯酰胺(分离胶，10mL)：水4mL，30％丙烯酰胺溶液3．3mL，1．5mol，LTris(pH8．8)2．5mL，10％SDS0．1mL，10％过硫酸铵O．1mL，TEMED0．004mL。5％SDS聚丙烯酰胺(积层胶，3mL)：水2．1mL，30％丙烯酰胺溶液O．5mL，ImoULTris(pH6．8)O．38ml，10％SDS0．03mL，10％过硫酸铵0．03mL，TEMEDO．003mL．2XSDS凝胶加样缓冲液：O．2％溴酚蓝，lOOmmol／LTris"HClQH6．8)，200mmol／L二硫苏糖醇(DTr)，4％SDS(电泳级)，20％甘油。?考马斯亮蓝染色液：45mL甲醇，45mL水，10mL冰乙酸，0．259考马斯亮蓝R250。．脱色液：45mL甲醇，45mL水，lOmL冰乙酸。2．2．1．8其它试剂的配制PCR样品缓冲液：50mmoVLKCI，10mmol／LTris．HCI(pH9．O)，15mmoULMgCl2，0．01％明胶，O．1％TritonX0100，0．45％NP-40，0．45％Tween-20。O．ImoULCaCh溶液：取“．19CaCh溶于ddH20中并定容至1000mL，过滤除菌，分装后置-20℃保存，用于大肠杆菌感受态细胞的制备。X-gab溶剂为二甲基甲酰胺，储存液浓度为20mg／mL，储存管用铝铂封包，于-20"(3避光保存。IPTG：用ddE【20配制成lOmg／mL，过滤除菌，-20"C贮存。2．2．2方法2．2．2．1引物设计及合成：根据GenBank的BovlFN-Y已知序列及文献(OeneBank编号M29867)设计l对引物。上游引物PI：5’-ttggatectecgaaacaatgagttatae-3’设置BamHI酶切位点，P2：5’-ttgaattegatgacaattattttgatge-3’，设置EcoRI酶切位点．引物Pl与P2阃横跨整个ORF去除信号肽后的成熟肽编码区，预计扩增片段长度为446bp，引物由大连宝生物工程公司合成． 华中农业大学2006年硕十学位论文2．2．2．2淋巴细胞的分离培养、诱导及总RNA的提取无菌采集初生犊牛外周抗凝血，缓慢滴加在等量淋巴细胞分层液上，1000r／min离心20rain后，小心吸取血清与分层液之间的黄白色细胞层。PBS洗涤2次后，用含10％d'牛血清的DMEM液37℃、5％C02培养lh后，弃去贴壁的单核细胞。调整细胞浓度为2．5×106／mL，加入500IIg／mLPHA，37℃、5％C02培养10h后收集细胞。按Gibco公司1RIzOL试剂提供的程序提取总RNA。置--70℃保存备用。2．2．2．3RT-PCR扩增eDNA合成在PCR管加入总RNA5弘L，70℃作用5min后冷却到O℃，依次加入9．5ItL超纯水，5IIL5XAMV缓冲液，10mmol／L2．5IILdNTP、lpLRNAsin和1llLAMV反转录酶，于50℃反转录60min，95℃5min灭活反转录酶。PCR扩增在PCR管中依次加入超纯水34pL、10XPCR缓冲液5pL、反转录产物2|IL，10mmol／LdNTPIIlL，引物Pl和P2各lllL(50pm01)、25mmol／LMgCl25IlL，TaqDNA聚合酶llIL，PCR循环条件为95℃5rain，然后94℃lmin、55℃lmin、72℃1．5min、30个循环，72℃10min，4℃10min。反应结束后取5"C产物1％琼脂糖凝胶电泳分析．2．2．2．4PCR产物的回收与纯化，PCR产物按常规方法进行琼脂糖电泳，预期的特异性扩增片段大小如表2．1；琼脂糖凝胶内特异性片段的回收按试剂盒说明书进行。用0．8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下舍目的DNA的琼脂块，放入1．5mL灭菌离心管中，按每100rag琼脂糖胶加入4001tLBindingBuffer，置50-60℃水浴中10min，使琼脂塘凝胶充分溶化。将UNIQ4柱放入2mL收集管中，将融化的胶溶液转移到trNIQ．5柱中，室温静置2min。室温8000r／rain离心lmin；取下UNIQ-5柱，倒掉收集管中溶液，将UNIQ-5柱放入同一个收集管中，加入400pLWashSolution，室温10，000r／min离心30see，重复洗涤一次。取下trNIQ．5柱，倒掉收集管中的溶液，将tmiQ．5柱放入同一个收集管中，让离心管盖歼着，室温10。000r／rain离心15see=将LrNIQ-5柱放入一个灭菌的1．5mL离心管中，在柱子底部的膜中央加30I．tLElutionBuffer或ddH20，50"0水浴2rain=12000r／min离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20"C备用。2．2．2．5重组表达质粒pETBovlFN．Y的构建与测序用EcoRI和BamH1分别双酶切重组质粒pET-28a、PCRBov[FN-Y产物，用试剂盒回收得到目的片段和载体，用T4DNA连接酶进行连接反应(16℃水浴过夜)，转化DHSa，然后小量提取质粒，用EcoRI和BamHI酶切鉴定，构建的阳性重组质粒命名为pETBovIFN-Y。连接反应体系如下： 抗牛Y-干扰素单克降抗体制备及ELISA方法榆测方法的建它LigationSolutionI10．0‘‘LpET-28aVector0．5此PCRproducts9．5此16℃水浴保温2h以上或过夜．取约lO此连接产物转化DH5ct感受态细胞，在含Amp的琼脂平皿上进行筛选，用灭菌牙签挑取白色菌落，在含Amp(50ttg#7mL)的液体LB培养基中，250．300r／min3712过夜，提取质粒进一步鉴定。获得重组质粒pETIFN．Y，送大连TaKaRa公司测序。222．6大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)在LB琼脂平皿上挑取单个大肠杆菌DH5a或BL21(DE3)菌落，接种于2mLLB液体培养基中，37℃250．300r／min振荡培养5．6h后，将细菌加到50mLLB培养基中，3712250-300r／min继续培养约3-4h，振荡培养至OD600为0．6时，在无菌条件下将菌液转移到用冰预冷的50mL离心管中，冰浴30min，4℃5000r／rain离心10min，弃上清。将管倒置lmin使残留培养液流尽后，于沉淀中加入冰预冷的O，lmol／LCaCl210mL，轻轻重悬细菌沉淀，冰浴30rain后，4000r／min离心10min，弃上清，沉淀中加入0．1moI／LCaCl2约2mL(视细菌量而定)，轻轻重悬菌体，可直接取少量(约1001xL)转化或放冰浴中置412短期存放；如需低温保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15％，分装100pL／管，．7012低温冰箱保存备用。2．2．2．7连接产物及质粒的转化制备抗性平板，如需进行蓝，白斑筛选，则在转化前2-4h于LB平板上涂X．gal(20mg／mL)40此和IPTG(10rag／mE)80皿，正放于37"12温箱中，使X-gal和IPTG充分吸入琼脂中．取．70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，取200wE于一无菌的1．5mLEP管，加入连接产物(约5-100L)或质粒(1-2aL)，混匀，于冰上放置30min，42℃水浴热击90see，然后冰浴静置2mill，加入400pLLB液体培养基，37℃200．220r／min摇床培养45rain，离心后留2009L培养液重悬菌体涂平板，37℃培养至单菌落出现。2．2．2．8质粒的提取质粒的小量提取(碱裂解法)；用灭菌牙签在平板上挑取单菌落，接种于4mLLB液体培养基中，3712250．300r／rain培养过夜，将菌液转入1．5mL离心管内，12000r／rain离心30see，弃上清，倒立离心管，使液体流尽，然后加入100ttL预冷的溶液I。涡旋使茵体充分悬浮，加入2001xL新配的溶液II，反复颠倒离心管几次，冰浴5rain，加入150止冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻颠倒数次后，冰浴5min后，室温12000r／min离心5min，吸取上清至另一1．5mL离心管内，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置5min，12000r／rain离心5min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，抽干或自然干燥，用200pLl7／(prig．O)充分溶解沉淀后，加入7．5mol／LNH4Ac100止，混匀，冰浴静置5min，12000r／rain离心5min，吸取上清到另一支1．5mL离心管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，置-201230min，12000r／rain离心5min，弃上清，沉淀用75％ 华中农业大学2006年硕士学位论文冷乙醇漂洗，抽干后溶于适量含Rnase的ddH20或TE(pro．0)，56℃水浴30min或37℃过夜以除RNA，取样(约1-21儿)电泳观察所提取质粒量的大小，其余嚣．20℃冰箱保存备用。质粒的大量提取(碱裂解法)：将已鉴定的重组子接种于100mL含相应抗生素的LB液体培养基中，3712250．300r／rain振荡培养过夜，将菌液转至50mL离心管中，5000r／rain离心10min，弃去上清，收获细菌沉淀，向沉淀中加入3mL预冷的溶液I充分悬浮菌体，加入6mL新配的溶液II，颠倒数次，冰浴10min，加入4．5mL预冷的溶液Ⅲ，颠倒数次后，冰浴10min，10000r／min离心10min，转移上清至另一离心管中，加0．6倍体积的异丙醇，室温静置10min；室温10000r／min离心15min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇洗涤后，抽干，加入1．5mLTE(pH8．o)充分溶解沉淀，加入5moFLNH4Ac1．5mL，混匀，41210000r／rain离心10min，将上清转移到7mL离。心管中，弃沉淀，向上清中加入等体积(3mL)的异丙醇，置．20℃30rain，室温10000r／min离心10min，吸弃上清，用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，抽干，加入pH8．0的TE500肛L，使沉淀充分溶解后转至1．5mL离心管中，加入RNase，5612lh除RNA，再加入现配制的13％PEG$000(含1．6moI／LNaCI)5001tL，-20℃沉淀30rain，41212000r／min离心5rain，弃上清，用40％LTE(pn8．o)重悬沉淀，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提2-3次，12000r／min离心5rain，吸上层水相到另一l-5mL离心管中，加入10mol／LNH4Ac100I_tL及lmL冷无水乙醇混合，置．20℃30min，12000r／min离心5min，弃上清，用预冷的75％乙醇洗沉淀，抽干，加200ItLTE(pH8．0)溶解沉淀，取O．5皿在0．8％的琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果，剩余部分置．20℃保存备用。2．2．2．9重组质粒的酶切鉴定挑取阳性的重组子，接种到含相应抗性的液体LB培养基中，3712250．300r／min培养过夜，小量抽提质粒，用适当的限制性内切酶消化，O．8％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下观察结果。2．2．2．10诱导表达将空白载体和重组质粒同时分别转化BL21(DE3)感受态细胞，在转化的平皿中挑取一个单菌落接种于含相应抗生素的3mLLB液体培养基，于3TC振荡培养约10-12h，至OD600达到0．6左右，放入412冰箱过夜。第二天，将培养物5000r／rain离心5min，然后用新鲜LB洗涤1次，沉淀用3mLLB悬浮，取100肛L接种于10mL含相应抗生素的新鲜LB液体培养基中，于3712振荡培养约3h，至OD600达到0．6左右时，加IPTG至终浓度为1．0mmoFL，继续培养3h，其问每隔lh(在第l、2、3、4h)取ImL菌液至EP管中。将收集于EP管中的细菌5000r／min离心5min，弃上清，加10(I皿无菌去离子水吹散混匀，加1001tL2XSDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，于10％SDS-PAGE电泳检测重组蛋白的表达．2．2．2．1l表达蛋白的纯化 抗乍y-干扰索荦克降抗体制备及ELISA方法榆测方法的建立挑一个pETBovlFN．Y克隆至2mlLB液中(Amp+)，37℃振摇至OD600值约至0．6，将2ml菌液加入100mlLB中，37℃振摇至OD600值约至0．6，加入IPTG至终浓度为ImM，继续摇2．3h，离心(5000rpm，5min，4"C)，用10×柱体积的bmdingbuffer悬浮细菌，超声破碎细胞，离心(12，000rpm，15rain，4℃)，取上清，用滤纸过滤，加0．5mlNi2+-NTAHisBindResin于层析柱，10×柱体积的bindingbuffer洗层析柱，样品过柱．6×柱体积的washbuffer洗层析杠。3×柱体积的elutionbuffer洗脱蛋白，收集蛋白0．5mt／#旨，取201xl样品SDS．PAGE鉴定2．2．2．12包涵体提取包涵体提取参照Marshak等(1996)的方法进行。取诱导表达3h的细菌培养物8000r／min离心lOmin，收集细菌，加1110原培养物体积的缓冲液A重悬，强超声波处理约8次，10s／次(冰上操作)，直到液体澄清透明，4"C12000r／min离心15min，取100l曲上清备用，将沉淀加等体积(离心前)缓冲液A重悬，取10011L加1001aL2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min，作为SDS．PAGE电泳样品。其余样品置．20℃备用。2．2．2．13不可溶性表达产物(包涵体)的溶解和复性包涵体提取同3．2．2．1．包涵体以原裂解体积的含O．3％SKL的缓冲液A重悬，振荡溶解，室温静置30min至2h使包涵体充分溶解，10000r／min离心10min，将上清转入透析袋并加入终浓度为0．2％的PEG4000和终浓度为50mM的氧化型谷胱甘肽与100mM的还原型谷胱甘肽，用生理盐水或TE(pH8．O)透析3日，3次／日，不用搅拌，．20℃分装保存(用于建立ELISA方法)o2．2．2．14SDS-PAGE电泳夹好玻璃板，将制好的10％SDS丙烯酰胺分离胶约5ml迅速灌入两玻板的间隙中，留出灌注积层胶所需空间，在分离胶上加入一层异丁醇，分离胶聚合后，倾出覆盖层的异丁醇液体，用去离子水洗凝胶顶部数次，用滤纸片吸净残留液体，再将刚制好的5％积层胶灌入分离胶上，立即插入梳子，待胶全部聚合后拔出梳子，用水洗去加样槽的残留液体，用针头拨取加样槽内的胶，使齿直立，固定于电泳装置，加电泳缓冲液，每孔加25．30止样品，将电泳装置与电源相接，将电压调到80V，待溴酚蓝到达分离胶时，将电压调到120V，等溴酚蓝溢出分离胶底部后半小时关闭电源，取出聚丙烯酰胺凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中染色4h以上，取出放入脱色液中脱色数次，每次30-60min．脱色完全后，取出观察分析． 华中农业大学2006年硕士学位论文2．3结果与分析2．3．1BovlFN-Y的克隆利用2．2．1．9的引物Pl与P2扩增BovIFN-Y，扩增片段大小约446bp，与预计大小一致(见图2-3)图2-3BovWN-YPCR产物鉴定Fig．2-3IdentificationofBovllrN-YbyPCR1-2：Controls；3-4PCR；M：DL-20002．3．2pETBovlFN-Y表达载体的构建与测序PCR纯化产物用EcoRI和BamHI双酶切，回收目的片段，与经EcoRI和BamHI双酶切的质粒pET-28a连接，转化EcoliDH5a，碱裂解法小量抽提质粒。EcoRI和BamHI双酶切鉴定阳性重组子(见图24)．鉴定正确的重组子送大连宝生物测序，测序结果与BovlFN-Y一致，命名为pETBovlFN-Y。(见附录1)图2_4重组质粒pETBovli聪-Y的酶切鉴定Vie,．2-4IdentificationofpETBovlFN-YdigestbyEcoRI和BamHIMr：DL-15000；1-2：pETBovlFN-Y，EcoRI和BamHI：M2：DL-2000 抗牛Y．干扰素单克隆抗体制备及ELISA方法检测方法的建证2．3．3表达产物的SDS—PAGE分析用重组原核表达质粒pETBovIFN．y、表达载体pET-28a分别转化大肠卡T菌BL21(DE3)，涂布卡那霉素平板，置37℃恒温箱培养，获得重组子。挑取单菌落接种于2mL含卡那霉素的液体LB培养基内，37"C振荡培养，经IPTG诱导表达3h后，离心收集茵体，收集的菌体经过裂解等处理，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，确定表达产物位于上清还是包涵体中。对于上清中的目标蛋白用组氨酸纯化试剂盒进行纯化，对于沉淀中的目标蛋白用提取包涵体的方法进行纯化，然后进行SDS．PAGE检测。pETBovlFN．Y表达的蛋白大小约22kDa．纯化后浓度为150lag／ml。结果如图2．5图2-5含pETBovlFN-Y重组菌的SDS-PAGE结果Fig．2-5SDS-PAGEanalysisofrecombinantBL21fOE3)cloneswithpETBovlFN-YM：ProteinmarkerSM-0431(MBl)l：LysateoftheBL21(OE3)transformedbypET-28a2：SuperaatantoftheBL21(DE3)transformedbypETBovlFN-Y3：InclusionbodiesextractedfromtheBL21(DE3)transformedbypETBovlFN-Y2．4讨论2．4．1BovIFN．Y基因的克隆PCR扩增的必须确保序列的准确。如出现基因突变、读码框的错读、提前终止及任何操作或试剂上的问题都可能影响或阻断基因的表达等。本研究中的BovlFN—v基因446bp扩增结果经过测序验证是正确的。 华中农业大学2006年硕士学位论文2．4．2BovIFN-Y基因原核表达载体的构建在引物设计时，考虑到如果酶切位点设计合理，在引物设计时，在引物中引入了EcoRI及BamHI位点，与pET-28a相应位点结合，可直接与原核表达载体连接。这样一方面可以减少若干个实验步骤，比如连接T载体，再酶切连接。加快了试验的进程，同时，T载体作为一种消耗品，减少步骤也可以降低试验的成本，减少试验结果的不确定性。2．4．3BovIFN-Y的作用干扰素(IFN)是在特定的诱生剂作用下，由细胞分泌的具有抗病毒、影响细胞生长分化、抗肿瘤和调节免疫功能等活性的糖蛋白，是最早发现、研究最多的细胞因子．IFN—Y主要由CD4+、Thl、CD8+T细胞及NK细胞产生，它除了具有抗病⋯毒、抗肿瘤活性外，更重要的是它还具有促进MHCII类抗原表达、增强APC细胞与T细胞相互作用、增强T细胞辅助抗体产生和细胞毒性T细胞产生能力等，一直是现代医学和生物学研究的一大热点。国外学者已先后利用酿酒酵母、PGEX．5x．1融合蛋白表达系统、巴斯德毕赤氏酵母系统、牛I型疱疹病毒载体(BaY．1)、昆虫细胞和家蚕细胞杆状病毒系统表达出rBovlFN．y，对其免疫和生物活性进行研究。2．5小结通过PHA刺激，从全血培养上清提取BovlFN．YmRNA,根据BovIFN．y基因的已知序列设计引物，经过RT-PCR扩增出BovIFN．YeDNA，定向插入原核表达质粒pET-28a，经测序确认正确，转化EcoliBL21，经IPTG诱导，表达出大小在22kDa左右的蛋白；通过对诱导剂的浓度、诱导起始时间、诱导持续时间的筛选，对表达条件进行了优化． 抗牛v．干扰素单克隆抗体制备及ELISA方法椅测方法的建立第3章抗BovIFN．Y单克隆抗体研究3．1研究目的意义1975年，KOhler和Milstein建立了杂交瘤技术，使人们能生产针对某一抗原决定簇的单克隆抗体。由于这种抗体具有高度单一性和亲和力，目前已广泛地应用于生物学和医学的许多领域。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系；生产出针对复杂生物混合物中的特定分子的抗体，可用于分离、分析及纯化该分子抗原；可用于临床诊断和治疗，或以单抗为弹头的“生物导弹”药物等。抗IFN-g的单克隆抗体(McAb)作为～种重要的研究、检测IFN-y的手段，在免疫机制研究、免疫功能检测、纯化基因重组IFN．Y(rIFN．Y)等领域具有广泛的应用。IFN-Y的免疫学检测(IFN-Y试验)是在特异性抗IFN．YMcAb的基础上建立的用于对样本中的IFN．Y进行定性定量分析的实验方法，己被广泛地用于研究基础和临床免疫学、疫苗免疫效果评估、器官移植、过敏反应以及多种胞内病原感染的诊断等。1FN-g及其McAb在畜牧兽医领域也有着广泛的应用。国外己有学者将基因重组牛IFN-Y(rBovlFN-Y)及其McAb用于牛病的研究，抗原特异性的牛IFN．Y试验已在很多发达国家被用于多种牛疫病的检测，尤以在牛结核病诊断中的应用最为广泛，相关的研究也最为深入，国内相关方面研究的报道比较少。本研究用大肠杆菌表达的重组蛋白BovlFN．Y作为免疫原，制备了抗BovIFN．Y的单克隆抗体和多克隆抗体，并对单克隆抗体进行了分析和鉴定．3．2材料与方法．3．2．1材料3．2．1．1细胞、菌株、载体、动物SP2／O多发性骨髓瘤细胞由本室保存。SPF级Balb／C小鼠购白湖北省疾病控制中心实验动物中心。3．2．1．2培养基及主要试剂RPMI·1640、HAT混合盐、HT混合盐(100X)、佛氏完全和不完全佐剂均购自Gibcol公司。新生小牛血清(超级)购自杭州四季青生物工程公司，精制小牛血清购自Hyclone公司。融合剂50％PEG(P7181)和8．氮鸟嘌呤为Sigma公司产品．青、链霉素为华北制药厂产品．羊抗鼠igG、GI、G2a-HRP为SBA公司产品。3．2．1．3培养基及主要试剂的配制RPMI-1640基本培养基的配制：取一包RPMI-1640粉剂(1L)溶于900mL三蒸水中，加入29NaHC03待其完全溶解之后，用C02调pH至6．5．6．8(液体呈桔红色)，0．2211m过滤除菌，分装成100-200mL／瓶，取l小瓶于37℃作无菌检测，其余于4"C保存。 华中农业大学2006年硕士学位论文RPMI．1640完全培养基：于89mLRPMI-1640基本培养基添加lmL青链霉素贮存液(终浓度青霉素100U／mL，链霉素100I_tg／mL)，10mL新生小牛血清(融合时血清量可加至20％1。HAT培养基：于99mLRPMI．1640完全培养基加入lmLHAT盐(100x)，于4"C保存。HT培养基：于99mLRPMI．1640完全培养基加lmLHT盐(100x)，于4。C保存。双抗贮存液(100X)：将青、链霉素用无菌水溶解配制成含10，000U／mL青霉素和10,000U／mL链霉素的贮存液，于-20"(2保存。8一氮鸟嘌呤(100X)：取40mg溶于10mLddH20中，加几滴氨水，混匀溶解后加ddH20至20mL，过滤分装，4℃保存。HAT(100×)：用无菌注射器吸10mLRPMI．1640基本培养基(或三蒸水)，加入，盛HAT干粉的瓶中(不打开橡皮塞，保持无菌状态)，充分溶解后，于412保存。杂交瘤细胞冻存液：新生小牛血清和DMSO以9：l的比例混合，密封于4"C保存。3．2．1．7Westemblot缓冲液的配制电转缓冲液：39mmol／L甘氨酸，48mmol／LTris碱，0．037％SDS(电泳级)，20％甲醇。1000mL电转缓冲液：2．99甘氨酸，5．89Tds碱，0．379SDS，加200mL甲醇，加水至总量为1000mL．TBS(pH8．01：10mmol／LTris·HCI，150mmol／LNaCI。TBST：含0．05％Twecn-20的TBS。封闭液：含5％(w／v)脱脂乳的TBST．显色液：6mgDAB溶于9mL0．01MTds-HCI(Ph7．6)，加入lmLO．3％(w／v)CoCl2与lO儿30％H202。丽春红S(10X)贮存液：29丽春红S，309三氯乙酸，309磺基水杨酸，加水至100mL。3．2．2方法．3．2．2．1单克隆抗体制备的技术路线单克隆抗体的制备按图4-l进行。3．2．2．2抗原的制备将pETBovIFN—Y转化EcoilBL2l(DE3)，转化子的诱导表达，rBovIFN-Y为组氨酸试剂盒纯化蛋白，方法见2．2．2．10。3．2．2．3动物免疫用rBovIFN．Y免疫4．6周龄的雌性Balb／C鼠各5只，免疫程序为；皮下注射福氏完全佐剂乳化的重组抗原各100pg／R2周后皮下注射福氏不完全佐剂乳化的等量抗原，2周后皮下注不加佐剂的等量抗原．每次免疫后l周采血用间接ELISA监测动物产生的抗体滴度；间隔至少1个月后，选择抗体滴度高的Balb／C鼠在融合Iii『 抗牛Y·干扰素单克隆抗体制备及ELISA方法榆铡方法的建它的第3-5天脾内和尾静脉注射裸露重组抗原各200-300pg／只进行加强免疫，连续免疫3天·廖～、。：≮lCiC|Rt誓。、裟．。●}O|。o|㈨≥翟≯l≯；+∥|l≯i～二一，～一型型。型唾南蟪蟪n—_婚均dL，■■曲№m■h∞*I●’毪置、‘＆霄!≈疆、图4-l单克隆抗体制备的技术路线Fi蛋*-tSchemeofmonoelonalantibodyproduction3．2．2．4SP2／O骨髓瘤细胞的活化．，将细胞瓶中培养或复苏的SP2／O细胞，收集起来用O．5mLRPMI．1640基础液悬浮(O．5．1×106)注射Balb／C小鼠背部皮下．待9-lO天实体瘤生长后，视大小选择取骨髓瘤细胞的时间。3．2．2．5SP2，o骨髓瘤细胞的制备若是细胞瓶中培养，直接用RPMI．1640基础液洗下，离心收集即可。从小鼠实体瘤中制备SP2，o骨髓瘤细胞的方法如下：、1)将小鼠断颈处死，75％酒精浸泡5mira。2)撕开小鼠皮肤将肿瘤块剪下，置无菌匀浆器中，加5mLRPMI．1640基础液充分研磨后，补加10mLRPMI．1640基础液，混匀后静置5min，吸取上层的细胞悬液于一离心管备用，再补加10mLRPMI．1640基础液重悬组织，如此重复洗涤两次，将细胞悬液1200r／min离心8min后用20mLRPMI．1640基础液重悬。3)于另一50mL离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将细胞悬液轻轻地加于淋巴细胞分离液之上(比例为l：2-l：1)，1800-2000r／mlOmin，用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，用RPMI．1640基础液洗涤2次，计数后备用。4)小鼠脾脏用于制备饲养细胞。3．2．2．6免疫脾细胞的制备制备免疫脾细胞，用于细胞融合。免疫脾细胞为可分析特异性抗体的淋巴细胞。1)取经最后强化免疫的BMb／C鼠一只，眼眶放血处死(收集血液分离血清，即为阳性血清)，75％酒精中浸泡5min．2)将消毒好的老鼠固定于解剖板上，前肢固定，后肢交叉(左后肢在上)固定，用镊子夹住下腹部皮肤，剪一小口，撕开皮露出腹膜，换一套镊子和剪刀，剪开 华中农业大学2006年硕士学位论文腹膜，暴露出脾脏，再换一套器械，用镊子夹住脾脏，用剪刀去掉粘连在脾脏的脂肪组织，剪破脾脏外膜，放入无菌的匀浆器中．3)加3mL1640基础液于匀浆器中，研磨(不能太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器)，挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加7mLRPMI．1640基础液，静置5min，吸取上层细胞悬液于一无菌的50mL离心管，再补加10mLRPMI．1640基础液于匀浆器中，如此重复洗涤2次。4)1000r／min离心10min去上清，细胞用RPMI．1640基础液重悬后计数。3．2．2．7饲养细胞的制备在进行细胞融合及细胞克隆化的过程中，由于细胞密度很低，需要由饲养细胞提供适合杂交瘤细胞生长的环境及营养。1)取一只未免疫的Balb／C鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。2)四肢固定后，先撕开皮，露出腹膜，在腹膜上剪--4,口(在腹部中央)，然后用吸管3mLRPMI．1640基础液注入小鼠腹腔，轻轻吸打几次，再将液体吸出放于一50mL离心管，再重复一次，此为腹腔巨噬细胞。3)同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中．4)1000r／m离心10min去上清，细胞重悬后计数，置37℃备用。3．2．2．8细胞融合细胞融合按史良如(1984)的方法进行。1)将SP2／O骨髓瘤细胞与免疫细胞(1：3-l：10)于50mL离心管中混匀，1500r／min，离心10min。2)倒空上清(可用灭菌的滤纸吸干)，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。3)将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在lmin内慢慢滴入预温至37℃的50％PEGO．8mL(Sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。4)继续搅拌30see后静置lmin。5)慢慢加入37℃预温的RPMI．1640基础液10mL．具体方法为：第一分钟逐滴滴入lmL．第二分钟加lmL，第3．4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后缓慢加入30mLRPMI．1640基础液。6)1000r／min离心5min，去上清于37℃放置5．8min。7)用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔培养板中，约250I_tL，孔。～般按SP2／O的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2／O细胞。8)于37℃，5"／*C02培养箱中培养。9)融合后第二天开始观察，有无污染，于第4天补加l滴HAT培养基，第8．10天吸去lOOM．,培养基换HT培养基100止．待融合细胞集落长至培养孔l／4，培养基略变黄时，进行抗体检测。3．2．2．9间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清 抗牛Y．干扰索单克降抗体制备及ELISA方法检测方法的建立抗原包被酶联板，洗涤三次，加封闭液，于37℃温育lh，洗涤三次，然后加入杂交瘤的培养上清，于37℃温育lh，洗涤液洗三次后，加入l：5000稀释的羊抗鼠IgG．HRP，37℃反应lh。洗涤三次后，加入TMB底物液显色10rain，用O．25％HF终止反应之后，在630nm的波长下测OD值。同时设SP2，o细胞的培养上清作为阴性对照，OD630大于阴性对照2倍的样品为阳性。3．2．2．10杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法)由于融合产生的杂交瘤细胞实际是针对与同一种特异性抗原多种抗原的混合物。可以通过克隆化的方法筛选针对某一种抗原的单克隆抗体。1)克隆前或者莳一天制备小鼠饲养细胞层2)将杂交瘤细胞从培养孔内轻轻地吹下，用血细胞计数板计数活细胞数。3)将细胞用完全培养基稀释到5、10和50个细胞／毫升。4)将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100I^L／孔，使相应的每孔平均分别为0．5、l和5个细胞。5)培养第4天换液一次，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。6)特异性抗体的检测：在克隆后第7-9天，细胞克隆长满培养孔l，3．1／2时，即可检测，如检出细胞生长孔呈阳性，可选择抗体效价高，呈单克隆生长，形态良好的细胞孔，继续同法再克隆。7)阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可转种至小方瓶中，并冻存2支以上的细胞。3．2．2．1l杂交瘤细胞染色体数的检测杂交瘤细胞染色体数计数按章谷生和容秉培(1987)的方法进行，在细胞传代培养48h后加入秋水仙胺，使最终浓度达到O．04¨g／mL，继续培养2-2．5h。终止培养，将贴壁的细胞全部用吸管吹下，移入10mL的离心管，以1000r／m离心10min，弃去上清液。加入37℃预温的0．075mol／L的KCI低渗溶液5mL，用吸管吹打均匀，置37℃水浴15．20min。每管加入新鲜配制的固定液(甲醇：冰乙酸-3：1)lmL混匀，以1000r／m离心10min，去上清。再每管加固定液5mL，轻轻混匀，静止30min后，以1000r／m离心10min，弃上清．再次固定，加固定液5mL，轻轻混匀静止30min,以1000r／m离心10min,弃上清，用同样方法加固定液5mL打匀，封上管口于4℃静止过夜．轻轻吸去上清液，留下O．5mL左右的上清液，混匀，用滴管吸取细胞悬液2．3滴，滴在已用冰水浸泡的洁净的载玻片上，立即吹散，并在火焰上通过几次，促使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。以lO％Gicmsa染液染色10min，计数。3．2．2．12单克隆抗体的生产和效价测定建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液，用间接ELISA测定效价．也可在小鼠体内诱生小鼠腹水生产单克隆抗体，取8．10周龄的小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡0．5mL／只，7-lO天后腹腔注射杂交瘤细胞5X10s．106，只，7-10天后抽取小鼠腹水，离心取上清，用间接ELISA测定效价，并冻存杂交瘤细胞． 华中农业大学2006年硕十学位论文3．2．2．13单克隆抗体亚类鉴定单克隆抗体的亚类用间接ELISA鉴定，使用的二抗为羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP。方法见3．2．2．9。3．2．2．14单克隆抗体的结合活性及特异性鉴定用间接ELISA鉴定BovlFN．Y单克隆抗体的结合活性及特异性。『日J接ELISA的包被抗原为提取的BovlFN．Y重组蛋白。用间接ELISA和Westernblot对BovlFN．Y单克隆抗体进行特异性鉴定。用于鉴定BovlFN．y单克隆抗体特异性的抗原有A985B、ESAT-6／CFP．10、PPD、GM-CSF。3．2．2．15WesternblotWesternblot主要的作用是检测蛋白质之间的作用。首先将BovlFN．Y蛋白进行SDS．PAGE，然后进行转膜，最后进行杂交和显色。．转膜：当SDS．PAGE电泳将结束时，用蒸馏水淋洗石墨板，用不被吸收的纸巾擦干。戴上手套，剪6张3MM滤纸和l张硝酸纤维素滤膜。滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶。把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的上面，先借毛细作用使膜从下往上润湿后，将膜完全浸没于水中，浸泡5min除去滤膜上残留的气泡，用软铅笔在滤膜一角做标记。在一托盘中加入少量电转缓冲液，把6张滤纸浸泡于其中。戴上手套安装转移装置，平放底部电极(阳极)，石墨一边朝上，在这一电极上放置3张浸泡过的滤纸，精确对齐，以玻璃棒赶出气泡，把硝酸纤维素滤膜放在滤纸上，保证对齐，没有气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略略漂洗一下，然后精确平放于硝酸纤维素滤膜上，凝胶左下角与滤膜标记对齐，戴手套排除气泡。把最后3张滤纸放在凝胶上方，同样保证精确对齐不留气泡。将上方的电极(阴极)盖于夹层物上，石墨一边朝下，连接9V电源，电转移15．30min，具体时间依表达产物大小而定。断开电源后，把硝酸纤维素滤膜转移至丽春红染色液中，染色至膜上出现蛋白带。用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，其间换水数次。杂交：将NC膜于TBST中漂洗后，将NC膜转入可加热密封的塑料袋中，按0．1mL-0．15mL／cm2(NC膜面积)加入封闭液，尽可能排尽袋内的气泡，之后加热密闭袋口，室温平缓摇动1．2h或4℃过夜。然后弃封闭液，将膜取出，转入新的塑料袋中，按O．1mL．0．15mL／cm2的量加入经封闭液稀释(1：50)的血清(APP各血清型标准菌株及0306SYML感染鼠血清)，同上排除气泡并密封袋口，在摇床上室温作用30-40rain，TBST洗3次，每次5min，将膜转入新塑料袋中，按O．ImL-0．15mL／cm2加入经封闭液稀释(1：3000)的羊抗鼠IgG．HRP，室温反应30min，TBST洗4次，每次5min，TBS漂洗2次后，置于显色液中至出现明显蛋白带，立即用ddH20终止，即可观察并照相． 抗牛Y．干扰素单克降抗体制备及ELISA方法检测方法的建立3．3结果与分析3．3．1免疫用抗原的制备用BovlFN．Y提纯蛋白进行免疫。见2．3133．3．2免疫动物血清效价对于用BovIFN．y提纯蛋白三免以后的Balb／C鼠，尾静脉取血。置于4"0过夜，3000r／m离心10rain，取上清作为检测物。用BovIFN．Y蛋白包被ELISA板，将血清以100倍稀释后，倍比稀释检测血清抗体的效价。结果表明Balb／C鼠产生的抗BovIFN．Y抗体的效价为27X100。结果见图：32．52l1．5lo．50＼、一弋、r＼．。1、卜1．1248163264128256512102420484090dilution(X100)：Fig．3-2ELISAtitersofserafromimmunalmice3．3．3细胞融合细胞融合之后，于37℃5％C02培养箱中培养。融合当天观察细胞形态，其中有杂交瘤细胞，未融合的骨髓瘤细胞，脾细胞腹腔巨噬细胞以及红细胞等等。24h之后观察是否有污染的存在．2-4天瘤细胞逐渐消失，少数形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮，成葡萄串状，分布似融合细胞克隆，少则3．5个，多则lO余个成簇分布，其细胞数与日俱增。5-6天，克隆继续增大，细胞透亮，此时对有克隆生长的孔作上标记，以便检测。7-9天生长的融合细胞集落继续增大，当布满1／4-I／3培养孔的面积，此时可取上清检测抗体．3．3．4杂交瘤细胞的筛选及克隆化杂交瘤细胞上清首先用BovIFN-Y包被的酶联板来初步筛选，得到的阳性孔，再用相应的空表达载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)裂解液及标准的提纯BovIFN—Y作为对照与BovlFN．Y平行检测，经过多次检测，抗体特异性稳定．用有限稀释法克隆3次后获得4株稳定分泌抗BovlFN-Y单克隆抗体的杂交瘤细胞，连续培养，细胞生长良好，反复冻存与复苏后，仍保持稳定的抗体分泌能力，将其分别命名为克隆A7、A10、G6、G10． 华中农业大学2006年硕十学位论文3．3．4单克隆抗体的生产和效价测定用BovlFN—Y作为抗原，通过问接ELISA测定相应杂交瘤细胞和SP2／O骨髓瘤细胞诱生的小鼠腹水滴度，腹水从1：100开始稀释，结果见图。以SP2／O骨髓瘤细胞诱生的腹水的OD630值降低幅度最高作为ELISA滴度的终点，从图中得出，克隆A7、A10、G6、G10的ELISA滴度分别为100X29、100X210、100X29、100X29。““’。=窝葛器器譬葛霉一N∞2呙dilution(×100)Fig．3-3ELISAfitersofascitefluidsinducedbyMeAb3．3．5多克隆抗体的生产和效价测定用BovlFN·Y作为免疫抗原，免疫日本长耳兔，三免之后通过间接ELISA测定血清滴度，血清从l：100开始稀释，结果分别见图。以血清OD630大幅度下降点作为ELISA滴度的终点，从图中得出，多克隆抗体的ELISA滴度分别为lOOX29。。．IL—l—I、-—-、-。J、＼一、1⋯⋯f∞∞“_∞一n∞鬟器晶型琵dilatim(×1∞)图3-4多克隆抗体血清效价Fig．3-4ELISAtitersof∞rafromascitefluidsinducedbyPolycloualantibody3．3．6杂交瘤细胞染色体数的检测’杂交瘤细胞染色体计数结果见表3-l，从表中可以看出，SP2／O的染色体的平均数为70，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在79．94之间。均高于两亲本细胞的染色体数目，说明这六株细胞的确是杂交产物。异∞8 抗牛g．干扰索甲克降抗体制备及ELISA方法检测方法的建屯，图3-5杂交瘤细胞染色体数的检测Fig．3"5Numberofchromonteofhybridizedcells3．3．7单克隆抗体亚类鉴定以羊抗鼠lgG、G1、G2a-HRP为酶标二抗，用间接ELISA鉴定了单克隆抗体的亚类，结果见表3-1。表3．1单克隆抗体亚型及相应杂交癌细胞染色体计数Table3-1IsotypeoftheMeAbsandthenumberofthechromosolllesofhy’bridomas3．3．8BovIFN．Y单克隆抗体的结合活性与特异’性用BovlFN-g包被酶标板，用间接ELISA法及western-blot测定所得的抗BovlFN．g单克隆抗体与BovIFN．g结合能力及其特异性，结果见表3—2。表明抗体结合与目标抗原处(22kDa)。用相应的检测抗原300ng／nll包被ELISA板，检测与单克隆抗体的结合能力从这些图表数据可以看出，所有单克隆抗体均与BovIFN-Y反应良好，而与其它抗原不反应，说明所得的单克隆抗体确实分别为抗BovIFN-Y的单克隆抗体且特异性良好． 华中农业大学2006年硕七学位论文表3-2间接ELISA法测定单克隆抗体的结合活性与特异性Table3-2DeterminationoftheaffinityandspecificityofthemonoclonalantibodiessecretedbythedifferenthybridomasusingindirectELISA+：AscitefluidssecretedbythehybridomaweredilutedI：1000intIIeindirectELlSA．图3-6western—blot检测单克隆抗体及多克隆抗体结合能力vtg．3-6IdentificationofafiinityaudspecificityofthemonocloualantibodiessecretedbydifferenthybridomaagainstBovll州-TusingWesternblotauabⅧ缸M．proteinmarkerI．PeAb2．MeAbA73．McAbA104．McAbG65．MeAbG104．4讨论4．4．1免疫用抗原虽然与传统的抗体生产比较，杂交瘤技术的主要优点之一是，只要能设计出区分抗目的抗原抗体与抗其它成分抗体的筛选方法，免疫用的抗原纯化的要求不一定要求很严格。但是纯化的抗原可以减少无关杂交瘤的产生，从而减少工作量，提高工作效率，本研究中的抗原均为较纯的组氨酸纯化的BovlFN吖蛋白。4．4．2动物的免疫免疫Balb／C小鼠用于制备单克隆抗体，免疫日本长耳兔用于制备多克隆抗体。因为一般应用的骨髓瘤细胞都来源于Balb／C品系的小鼠，因此，选择Balb／C小鼠作为免疫鼠是最适宜的。用可溶性蛋白免疫动物时，常用弗氏佐剂乳化后免疫，以40 抗牛Y-干扰素单克隆抗体制各及ELISA方法检测方法的建立提高免疫效率，而且试验过程中乳化的程度对于抗体的产生也有一定的影响。本研究中的免疫途径主要采取脾内、腹腔途径免疫。4．4．3细胞融合细胞融合是整个杂交瘤技术中最关键的一步。所使用的瘤细胞在融合时必须处于旺盛生长阶段，可以通过注射小鼠产生的实体瘤之后，再分离瘤细胞，这样操作的融合率高于用细胞瓶中培养的骨髓瘤细胞。为防止骨髓瘤细胞系返祖，可以每隔一段时间，将细胞在含有8．氮鸟嘌呤(2099／mL)的条件下予以选择。细胞融合选择采用的是HAT系统(Littlefiecd，1964)(见图4．7)。在这个系统中，用氨基喋呤(HAT中的A)阻断核酸的主要生物合成途径。正常细胞在次黄嘌呤和胸嘧核苷(HAT中的H和T)存在的情况下，可利用补救途径继续合成核酸。如果缺乏补救途径中的必需的一种酶一次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)的突变细胞，在有氨基喋呤存在的条件下，不能增殖而死亡．目前所用的SP2，O以及其他的一些骨髓瘤细胞就是HGPRT缺失的突变株。在融合使用这一些细胞作为亲本细胞，在HAT培养基中不能生长。融合细胞由于含有来自正常细胞的HGPRT基因，所以在HAT培养基中可以存活。这一系统称为半选择系统，因为融合的两个亲本中仅有一个存在遗传缺陷而被HAT培养基选择．在没有特殊刺激物质和特殊条件时，脾细胞在培养物中不生长，因此，没有必要对未融合的脾细胞进行选择(Zola,1991)。脾细胞的活力是融合成功与否的主要决定因素，因此，在制备脾细胞时应十分谨慎，用对细胞损伤最小的程序制备单个细胞的细胞悬液。在整个试验操作过程中都要十分小心。比如研磨小鼠脾细胞时，选择松一点的匀浆器，匀浆过程也要轻微用力，避免多次挤压以保持了较好的细胞活性．细胞比率，融合时脾细胞骨髓瘤细胞的比率一般为10：1。如果脾细胞已经富集，此细胞比率也可降至5：1或3：1。⋯毕主要生物合成途径f看爿p补救途径网弋蝴黼胸腺啼啶核苷图4．7HAT半选择系统Fi昏4-78emi-”leetionsystembyHAT41三囤 华中农业大学2006年硕士学位论文4．4．4杂交瘤细胞的筛选本试验采取ELLSA是作为筛选方法，它一次可以筛选大量的样本，并且特异性和敏感性较高，但是，所用必须是纯化的抗原，否则筛选出来的抗体可能含有针对抗原中其它成分的抗体。如果抗原不纯，则必需要作阴性对照，以排除产生非特异性的抗体的杂交瘤细胞株。本实验采取纯化的BovIFNff蛋白作为检测蛋白，同时用BL21表达的pET-28a空载体的细菌破碎产物作为空白对照。实验证明获得的单克隆抗体都是针对BovlFN-1,的特异性抗体。对于最后选择的单克隆抗体用购买的试剂盒标准样品进行了鉴定。4．4．5杂交瘤细胞的克隆在细胞融合成功，一旦鉴定出产生目的抗体的集落，应当尽早地将杂交瘤细胞⋯克隆化。克隆的目的是利用单个细胞培养的技术从细胞群体中选育出遗传稳定而同源的细胞系。在原始的融合孔内，杂交瘤细胞可能是由多个融合细胞组成的。而且，在融合后的最初几天，染色体容易丢失，可能导致McAb产生能力消失。尤其不分泌抗体的突变株往往比分泌性杂交瘤细胞生长快，可能抑制分泌性杂交瘤细胞的生长。在随后的杂交培养过程中，如果发现所产生的抗体滴度下降，也有必要进行再次克隆。有限稀释法由于不需要特殊的仪器，操作简单是使用的较多的一种方法。在这一方法中将杂交细胞悬液稀释至特定浓度分种入单个的培养孔中，为了取得单个细胞的集落，另一方面为了避免克隆失败造成细胞丢失，可在一块培养板上分配每孔含不同浓度的细胞，一般在其中一个浓度水平上能获得理想的结果。为了确定已经获得单克隆抗体杂交瘤细胞，需要从克隆的第三天起，认真观察细胞生长状况，记录每孔有几个细胞群落。每次克隆选择稀释度比较高的阳性孔，比较容易迅速获得单克隆抗体杂交瘤细胞。如果连续2次克隆符合泊松分却的单个克隆生长孔数，而且全部生长孔的上清液均为抗体阳性反应，且阳性值比较均一，则可以认为已得到能分泌单一抗体的杂交瘤。4．4．6杂交瘤细胞的冻存和复苏由于细胞培养中经常存在着污染和细胞死亡的危险，为了保证杂交瘤细胞不丢失，尽早冻存细胞是十分重要的，在克隆化之前，在克隆化的过程中，以及建立杂交瘤细胞株之后，都应尽快冻存．冻存时要选取生长旺盛，形态良好的细胞。复苏的细胞活力下降，死亡细胞较多，应注意适时换液和细心观察，复苏时加入饲养细胞会有利于细胞生长，也可直接通过接种小鼠复苏。4．4．7污染和控制微生物污染是造成细胞融合，克隆化培养失败和细胞传代中断的重要原因之一．从细胞融合到建株成功至少需要3-4个月以上，加上操作程序繁琐，培养板和溶液 抗牛Y．干扰索单克降抗体制器及ELISA方法{舟测方法的建屯经常暴露于空气中操作，容易污染。这就要求时刻警惕污染的发生，一旦污染常常难以排除。在实验的各个环节都应仔细，如器材必须灭菌彻底。为了防止细菌污染可以在培养基中加入青霉素与链霉素，防止真菌污染则可加入抗真菌的抗生素，一般水剂较好，本试验采用2％的双抗。4．4．8IFN．y单克隆抗体的结合活性与特异性本研究采用提纯的BovIFN．Y及商品化标准样品，用间接ELISA和Westen．blot分析单克隆抗体的结合活性与特异性．所得的单克隆抗体均与BovlFN—Y反应，不与其他抗原反应，说明其结合活性及特异性良好。4．5小结利用大肠杆菌表达的重组蛋白BovIFN．Y作为免疫原制备了4株分泌抗BovlFN．Y单克隆抗体的杂交瘤细胞株，用ELISA证明其结合活性及特异性良好，，抗体亚类都为IgOl，用小鼠腹水生产的单克隆抗体ELISA效价分别为100X29、100X2∞、100X29与lOOX29，染色体众数平均值分别为84、87、86与89。j’ 华中农业大学2006年硕士学位论文第4章牛IFN-Y的双抗体夹心间接ELISA方法建立4．1研究目的和意义在单克隆抗体制备及多克隆抗体制备的基础上，建立BovIFN．Y的双抗体夹心间接ELISA方法，用于检测BovlFN．Y。检测了ELISA方法的敏感性和特异性，为建立奶牛结核病IFN．Y试验的检测方法奠定了基础。4．2材料与方法4．2．1材料4．2．1．1主要试剂及材料辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪，羊抗鼠IgG购自SouthcmBiotechnologyAssocimion(SBA)公司。实验用酶标扳购自深圳金灿华实业有限公司。其它各类试剂均为国产分析纯。4．2．1．2ELISA及IHA缓冲液的配制包被液(25mmol／L碳酸盐缓冲液，pH9．6)：Na2C031．599，NaHC032．939，ddn20加至1000mL，4"0保存备用。洗涤液(0．05％Tween-20PBS，pH7．4)：NaCI8．Og，KCl0．29，Na2HPO,·1211202．99，KH2P04O．29，Tween-200．5mL，ddH20加至1000mL。封闭液：O．29BSA溶于100mL洗涤液，4"C保存备用。底物缓冲液(磷酸盐．柠檬酸盐缓冲液，pH5．O)：0．2mol／LNaEHP0425．7mL，O．1moFL柠檬酸24．3mL，ddH2050mL，4℃保存备用。TMB母液：0．29TMB干粉溶于lOOmL无水乙醇中配制而成，4℃保存备用。底物液(TMB)(新鲜配制)：TMB母液用底物缓冲液按l：20的比例稀释，每毫升底物液加入0．2pL30％H202。终止液(0．25％HF)：I-IF(40％)625此，ddt／20100mL。4．2．2方法4．2．2．1最佳抗原包被量和血清稀释度的选择选取三个抗体包被浓度：l万、5万和lO万倍稀释，另外选取四个夹心抗体浓度；l千、5千、l万和lO万。将IFN-Y稀释100、200、400、1000、2000、4000、10000和50000。进行ELISA试验，整个实验重复三次，综合三次试验结果，以01)630值大幅度减小时抗原稀释度的前一稀释度的蛋白含量为最佳包被浓度，以最佳抗原包被浓度下阳性血清OD630值大幅度降低时血清稀释度的前一稀释度为血清最佳稀释度． 抗牛Y．干扰索单克隆抗体制备及ELISA方法检测方法的建立4．2．2．2牛IFN-v的双抗体夹心间接ELISA方法建立包被单克隆抗体A10，抗体用包被液适当稀释，每孔100ttL，置4"C过夜(8h以上)，加洗涤液每孔200儿洗涤3次，每次间隔3min．加封闭液，每孔200ttL．置37℃30rain．洗涤3次(同上)；加抗原(提纯BovlFN．Y或全血刺激产物)，抗原用保温液稀释，每孔100止置37℃lll’洗涤3次(同上)；加夹心的多克隆抗体，抗体用保温液适当稀释，每孔100止，置37℃lh，加洗涤液每孔200ttL洗涤3次，每次间隔3mira加HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，二抗用封闭液稀释，每孔加100ttL，置37℃30rain．洗涤4次(同上)；加底物液，每孔10Cl儿，室温避光10min，加终止液，每孔50皿，置室温5min，测每孔630nm处吸光(OD630nm)值。4．3结果与分析4．3．1最佳抗体包被量和抗原稀释度的选择通过调整包被抗体及夹心抗体的浓度，以建立敏感性和特异性比较好的ELISA方法。通过ELISA方阵，结果证明包被抗体浓度的为l万倍稀释，夹心抗体浓度为5000倍时最合适。／＼．．＼，、|．＼吣＼、’，飞!．一‘‘+’o·～‘一卜l24102040lOO500dilution(×100)图4-l最佳抗体包被量和夹心抗体稀释度的选择Fi晷4-1TitersofMcAbdetectedbysandwichELISA4．3．2BoyIFN-Y双抗体夹心间接ELISA鉴别方法研制结果将检测的抗原纯化IFN．Y从100倍开始稀释，依次进行倍比稀释，用A10包被ELISA板，纯化多克隆抗体作为夹心抗原，羊抗兔(HRP标记)作为酶标二抗。结果)作为酶标二抗．结果表明建立的ELISA方法用于检测BovIFN．Y的敏感性达到75ng／ml。25l5O5lOo竹口畚。 华中农业大学2006年硕七学位论文1．41．21昌0．880．60．40．20＼’～＼、k～．1Z48163Zb4lZ8dilution(×100)图4-2双抗夹心问接ELISA方法检测IFN-YFig．4-2IdentificationIFN-YbydetectedbysandwichELISA4．3．3结合活性及特异性试验结果分别用BovlFN—Y、A985B、ESAT-6／CFP—10、PPD、PHA作为检测抗原，用建立的『自J接夹心ELISA方法测定结合能力及其特异性，结果见表4-2。建立的间接央心ELISA方法检测BovIFN-y良好，与其他抗原不反应。试验证明建立的方法结合活性及特异性良好。表4-2鉴定ELISA方法结合活性与特异性Table4-2DeterminationoftheaffinityandspecificityofthesandwichELISAs4．4讨论4．4．1单克隆抗体的选择本试验制备了4株单克隆抗体及纯化的多克隆抗体。通过组合建立的抗体夹心间接ELISA方法对BovlFN．Y进行检测，对于敏感性和特异性比较好的组合，用商品化的BovlFN-y进行检测。4．4．2ELISA包被抗体最佳浓度和夹心抗体最佳工作浓度的选择由于双抗间接夹心ELISA方法的建立中，涉及的抗体比较多，而且实验的步骤也比较多，还有抗原及抗体包被反应的时间也要逐步的摸索．而且抗体的浓度对于双抗间接夹心ELISA方法的敏感性及特异性是一个辨证的关系．如果抗体的浓度提高，则会增加ELISA方法的敏感性，但会降低其特异性；同样，如果降低抗体的浓度，则会增加ELISA方法的特异性，但会降低其敏感性． 抗牛y．干扰素单克降抗体制备及ELISA方法榆测方法的建证4．4．3奶牛结核病IFN-Y检测方法抗原特异性IFN．g试验是一种体外T细胞免疫检测试验，被认为是有望替代TST的体外检测试验。一开始，研究者在抗原特异性IFN-Y试验中主要以PPD为刺激抗原，后来研究者开始尝试使用结核分支杆菌特异性的抗原，象ESAT-6、CFP-10等。与PPD相比，以特异性抗原作为检测抗原的抗原特异性IFN-g试验具有更高的特异性，较低的因BCG疫苗免疫或非结核分支杆菌感染引起的交叉反应等优点。但是，在抗原特异性IFN．Y试验中使用特异性单一抗原以提高检测特异性的同时，会牺牲一部分检测的灵敏度。而以多种特异性抗原组合作为检测抗原，可以克服这个缺陷。建立本夹心间接ELISA的目的主要是为了建立奶牛结核病IFN．Y检测方法，如果用结核特异性抗原刺激相应抗原免疫的奶牛，用建立的双抗间接夹心ELISA方法检测全血培养刺激产物，可用于检测奶牛结核病。由于奶牛全血培养的产生的BovlFN．Y只有约lOOng／ml，所以必须提高间接夹心ELISA方法的敏感性，同时保证方法的特异性。’3．5小结在单克隆抗体及多克隆抗体制备的基础上，建立BovlFN．Y的双抗体夹心间接ELISA方法，用于检测BovlFN-Y，ELISA方法敏感性到底75ng／ml，且不与其他检测抗原发生反应，表明建立的ELISA方法敏感性和特异性良好，为建立奶牛结核病IFN-Y检测方法奠定了基础。 华中农业大学2006年硕士学位论文第5章结论本实验通过PHA刺激，从全血培养上清提取BovlFN-YmRNA，经过RT-PCR扩增出BovIFN．YeDNA，定向插入原核表达质粒pET-28a，构建原核表达重组质粒pETBovIFN-y，经测序确认正确，转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导，表达出大小在22kDa左右的蛋白；以纯化的原核表达融合蛋白BovlFN．Y为免疫原，免疫BaIb，C小鼠，然后应用淋巴细胞杂交瘤技术，研制出4株稳定分泌抗BovlFN．Y单克隆抗体的细胞株，免疫球蛋白亚类鉴定都为IgGI，腹水效价为l：100X|09，l：100X1010l：100X109,l：100Xl09'Western-blot分析显示，4株单抗均能特异性结合22kDa的BovlFN-y，ELISA试验表明，4株单抗只与融合蛋白BovlFN．Y反应，而不与A985B、ESAT-6-CFP．10、GM．CSF反应，表明4株单抗均为针对BovIFN．Y的特异性单抗。选取单抗A10，纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔酶标二抗，建立双抗夹心间接ELISA方法，检测BovlFN．Y。实验结果表明，此ELISA敏感性达到75ng／ml，特异良好，不与其它检测抗原不反应。此ELISA方法为建立牛IFN．Y实验检测方法奠定了基础。48 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华中农业大学2006年硕士学位论文致谢3本论文是在导师陈焕春院士、谭亚娣副教授和郭爱珍教授的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验的设计与实施到论文的写作无不凝聚着导师的智慧和心血。导师渊博而系统的知识、严谨的治学态度、博大的胸怀、不畏艰难的拼搏精神及平易近人的作风将永远给我激励和鞭策，使我受益终生。谨此论文付梓之际，向导师致以最诚挚的敬意和衷心的感谢!感谢本实验室金梅林、周锐、赵俊龙、何启盖、方六荣、吴斌、肖少波、曹胜波、刘正飞、吴美洲等老师在学习和工作上对我的帮助和支持。感谢本实验室的胡巧云、陈颖钰、张桂荣、钦博、晁彦杰，曹莎、张书环、吴波、陈鑫、朱堂明、刘华兰等同学的帮助。实验室团结友爱的氛围，相互协作、积，一一极向上的精神，将让我永远怀念在实验室共同度过的时光。在学习期间，还得到了马艳、喻正军、贝为成、余晓岚、琚春梅、宋云峰、樊惠英、但汉并、张安定等，武汉科前生物制品有限公司李红超、曹毅、郭学波和董小辉等人的帮助，在此一并表示感谢。在此，我特别感谢我的父母家人及亲人，他们在我成长和学习的过程中一直是我的嚷强后盾，从精神和物质上都给予我全力的支持，他们的关爱和鼓励将永远激励着我。最后，衷心感谢和祝福所有关心我的师长、同学和朋友们。李川2006年6月于武汉