抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白 醇溶蛋白elisa检测方法的建立

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1、抗卵清独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得f注!翅瀣查墓丝霞要挂剔直塑的：奎拦亘窒2或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：豢镶乐签字日期：矽J口年占月／日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁

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3、食物过敏，被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。2005年7月19日，美国国会通过一项“食品过敏源标签和消费者保护法(FALCPA)"法案，要求食品生产商清楚地标明该食品是否含有8种最常见的食品过敏原。而在检验检疫系统对进出口的食品进行常见的8大类过敏原(蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝类)检测，缺乏相应的标准和方法。本文致力于研究鸡蛋和小麦过敏原的检测方法，并为制定相应的标准提供理论依据。卵清蛋白是鸡蛋的主要蛋白质，也是鸡蛋的主要过敏原之一。本文制备了抗卵清蛋白单克隆抗体，建立了常见过敏原鸡蛋卵清蛋白的ELISA检测方法。以PBS

4、溶解高纯度卵清蛋白，免疫8周龄的BALB／c小鼠3次，直至效价达到10弓之后，再加强免疫1次，三天后取小鼠脾细胞与SP2／O骨髓瘤细胞经PEG融合，经间接ELISA和有限稀释法筛选，获得了6株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别是OVA．1C6、OVA．2F9、OVA．2D8、OVA．2D2、OVA．3H6、OVA．3G9，培养上清效价分别为1：30000、1：30000、1：10000、1：10000、1：5000、1：50000，细胞冻存复苏后效价不变；OVA一1C6的亚型是IgG2b，OVA．2D8和OVA．2D2是IgG2a，OVA．

5、2F9、OVA．3H6和OVA．3G9的亚型是IgGl；与BSA、猪血清、兔血清均没有交叉反应。选取其中抗体效价最高的两株杂交瘤细胞OVA-2F9和OVA-3G9，制备腹水以及纯化，纯化后的抗体分别与HRP偶联。将偶联成功的HRP-2F9抗体作为酶标抗体，ovA一3G9作为包被抗体，经方阵滴定法确定最适的包被抗体浓度是1：200和酶标抗体工作浓度是1：1000，在最适浓度下优化双抗体夹心ELISA测卵清蛋白的条件。利用优化后的试验条件进行ELISA双抗体夹心法检测，建立卵清蛋白的标准曲线。检测的最佳线性范围是97．66ng／ml,-,6250ng／r

6、nl，r>0．995，最低检测限度为97．66ng／ml，大约O．1ppm。在同一次实验内，样品的回收率在91．92％--100．34％之间，精密度CV为1．22％0-5．14％，3次试验间精密度CV为3．17％-6．83％。可在4。C放置一个月。与鸡肉、猪肉、牛肉无交叉反应，对鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋中的卵清蛋白具有特异性。自制的ELISA试剂盒与RIDASCREEN成品试剂盒检测实际样品进行比较结果基本相符，并且检出灵敏度为成品试剂盒(1ppm)的10倍。醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原，约占小麦种子贮藏蛋白总量的40％，因此可以作为小麦的检测指标，

7、本文建立常见过敏原小麦醇溶蛋白的ELISA检测方法。以65％乙醇溶解sigma公司的小麦醇溶蛋白免疫BALB／c小鼠，免疫血清作为阳性对照。以鼠抗醇溶蛋白单抗为包被抗体，HRP标记兔抗醇溶蛋白多抗为酶标抗体，以方阵滴定法确定包被抗体的包被浓度是2l-tg／ml和酶标抗体的最适工作浓度是1：8000，在最适浓度下选择合适的封闭液，即含10％胎牛血清的PBST，建立双抗体夹心ELISA法检测醇溶蛋白，拟合标准曲线并制备醇溶蛋白试剂盒。检测的最佳线性范围是19．53～5000ng／ml，I逊O．99，最低检测限为19．53ng／ml，对应的食品样品检测限为

8、7．81ppm。样品的回收率在93．57％-105．72％之间，试验内CV为3．070／0-5．91％，试验