抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立课件.ppt

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1、硕士研究生论文答辩抗猪γ-干扰素单克隆抗体的制备及定量抗原捕获ELISA检测方法的初步建立报告内容研究背景研究思路与策略试验方法及结果讨论小结与展望研究成果研究背景-干扰素（IFN-）是机体内具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的重要细胞因子。它主要由激活的T细胞、激活的NK细胞和巨噬细胞产生。猪IFN-全基因编码166个氨基酸残基，包括20aa的信号肽(Dijkmans,1990)。信号肽切除后，产生146aa的IFN-单体，分子量为17.3kD，天然活性状态的IFN-是由两个IFN-单体经非共价交联形成的同源二聚体糖蛋白(Boeh

2、m,1997)。-干扰素概述IFN-γ的细胞分泌机制MHCII+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD4+T细胞,使幼稚CD4+T细胞转化为具有IFN-γ分泌功能和增殖能力的效应Th细胞。MHCI+抗原递呈细胞将抗原肽递呈给CD8+T细胞，使后者转化为具有IFN-γ分泌功能和增殖能力、靶细胞杀伤功能的效应CTL细胞。NK细胞和巨噬细胞被病原体所携带的LPS激活后，亦能分泌IFN-γ。TCR抗原肽MHCT细胞抗原递呈细胞T细胞IFN-检测的免疫学意义机体的细胞免疫状态监测药物的疗效评估细胞免疫功能分析病原体T细胞表位鉴定IFN-γ的免疫学检测方法抗

3、原捕获ELISA酶联免疫斑点试验免疫聚合酶链式反应细胞内细胞因子流式细胞术实时荧光定量RT-PCRELISPOT原理YYYYYYYYYYYYYY抗IFN-γ单抗IFN-γPBMC抗原特异性T细胞酶标链霉亲和素生物素标记检测抗体卵黄抗体的免疫学特性对细菌及哺乳动物蛋白抗原具有很高的亲和力不与细菌或哺乳动物Fc受体结合，因而不能激活补体系统不与哺乳动物血清中的类风湿因子反应，与哺乳动物IgG和IgM没有交差反应疏水性比IgG强，因而更容易包被于ELISA板和乳胶微球表面稳定性好生物素-亲和素系统生物素-亲和素系统是70年代末期发展起来的一种新型生

4、物放大系统，其具有以下几个显著特点：高灵敏度：由于每个亲和素分子可结合4个生物素分子，其结合常数高达1015mol/L，远远大于抗原抗体的结合常数（105-11mol/L），因而该系统具有放大作用，能显著提高检测的灵敏度。高特异性：亲和素和生物素的结合反应很强，并具有高度专一性。加上系统的高灵敏性，因而使试剂经得起高倍稀释，从而大大减少了通常免疫反应中出现的非特异性作用。高稳定性：亲和素与生物素一旦结合就很难解离，酸、碱、有机试剂、蛋白酶等均不影响二者的结合作用。本试验研究目的和意义本研究旨在应用生物素-亲和素放大系统，以单克隆抗体和卵黄抗体

5、为基础,建立一套检测猪IFN-的定量抗原捕获ELISA方法，为进一步建立猪IFN-的ELISPOT检测方法奠定基础。研究思路与策略YY杂交瘤腹水高免卵黄抗体免疫亲和层析生物素标记卵黄抗体亲和纯化单克隆抗体sandwichELISA原核表达IFN-γ亲和层析柱研究报告将在大肠埃希氏菌中表达的重组猪-干扰素（rpIFN-）免疫8周龄BALB/c鼠3次后，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按标准程序融合后，用表达的重组猪-干扰素和猪-干扰素标准品进行交叉筛选，获得1株能稳定分泌抗猪IFN-单克隆抗体的杂交瘤细胞株。利用Western-bl

6、ot分析和间接免疫荧光分析对该株单克隆抗体进行特异性鉴定。抗猪-干扰素单克隆抗体的制备单抗的Western-blot鉴定1.预染蛋白质分子质量标准(Fermentas);2.重组猪IFN-γ3.猪IFN-γ标准品（R&Dsystems);4.BSA二聚体?融合标签?CF-IFN-γ本单克隆抗体能够被猪IFN-γ标准品所识别单抗的间接免疫荧光（IFA）分析ABA：PMA刺激PBMC；B：未刺激PBMC本单克隆抗体能够被天然IFN-所识别分离猪PBMCPMA诱导单抗孵育荧光二抗卵黄抗体效价测定高滴度抗体出现时间早，持续时间长抗原特异性IgY的

7、纯化HCLCSDS-PAGE薄层扫描分析1.预染蛋白分子量标准2.(NH4)2SO4粗提IgY3.免疫亲和纯化的IgY卵黄分离氯仿脱脂硫酸氨粗提亲和纯化抗原特异性IgY的产率为0.26mg/mL卵黄液生物素标记的卵黄抗体的制备生物素标记的卵黄抗体的洗脱曲线抗体透析生物素标记抗体脱盐HABA分析平均每个IgY分子标记4.37个生物素分子生物素标记卵黄抗体的效价注：a.抗体起始浓度为500ng/ml；b.阴性对照为相同浓度的非标记卵黄抗体；c.OD490nm>4.0生物素标记的卵黄抗体具有良好的生物活性和较高的抗体滴度抗猪IFN-单克隆抗体的纯

8、化HCLC薄层扫描分析1.蛋白Marker；2.小鼠腹水；3.免疫亲和纯化的单克隆抗体SDS-PAGE亲和层析法纯化的单克隆抗体纯度为95.1%,与A/G蛋白层析纯