已烯雌酚和双烯雌酚单克隆抗体制备及elisa方法的研究

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1、摘要己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)和双烯雌酚(Dienestrol，DIEN)是人工合成的非甾体雌激素，由于具有促进蛋白沉积、提高动物日增重和减少脂肪合成等作用，曾经一度作为促生长剂广泛应用于畜牧养殖业。随着其致畸致癌等毒副作用广泛被人们所认识，许多国家和地区先后颁布禁令，禁止其应用于畜牧生产。由于受到经济利益的驱使，违法使用的现象依然存在。为了有效地监控动物性食品中的DES和DIEN残留，建立一种简单、快速、准确、灵敏的检测方法势在必行。本研究旨在分别制备抗DES和抗DIEN的单克隆抗体，建立DES和DIEN残留检测的ELISA

2、方法。1．活化DES和DIEN。针对DES合成了3种半抗原：己烯雌酚．单羧基丙基醚(DES．CP)、己烯雌酚．半琥珀酸(DES．HS)和己烯雌酚．单羧基甲基醚(DES—CM)，其中，DES．CP通过活泼酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联作为免疫原，DES-CP、DES—HS和DES-CM与卵清蛋白(ovA)偶联作为包被原。针对DIEN合成了2种半抗原：双烯雌酚一单羧基丙基醚(DIEN．CP)和双烯雌酚一半琥珀酸(DIEN．HS)，其中，DIEN．CP与BSA偶联作为免疫原，DIEN．HS与OVA偶联作为包被原。抗原经紫外扫描图谱鉴定，DES和DIEN分别与载

3、体蛋白偶联成功。免疫原经基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI．ToF-MS)测定，DES和DIEN与BSA偶联比分别为12：1和11：1。2．为了研究间隔臂对ELISA灵敏度的影响，设计了上述3种不同空间结构间隔臂的包被原(DES—CA—OVA、DES．CP．OVA、DES-HS．OVA)测定抗血清。将DES免疫原免疫新两兰白兔，获得了抗DES的多克隆抗体。结果表明4个碳链间隔臂异源结构的包被原(DES-HS—OVA)建立ELISA的灵敏度最高。以此包被原建立间接竞争ELISA标准曲线，DES在1-30ng／ml呈线性关系，ICso为7．0ng／

4、n[1l。同时，抗DES多抗成功的获得也为制备单克隆抗体打下了坚实的基础。3．为了制备DES和DIEN单克隆抗体，将DES和DIEN免疫原免疫BALB／c小鼠，经融合、选择性培养、筛选、克隆等步骤，获得了3株稳定分泌抗DES抗体的细胞株，分别命名为389、8F10和9C1；2株稳定分泌抗DIEN抗体的细胞株，分别命名为7H8和10D10。将细胞注入BABL／c小鼠腹腔生产腹水，硫酸胺纯化，SDS．PAGE电泳鉴定。间接ELISA测定抗DES和DIEN单克隆抗体效价都达到1：1．O×106。单抗亚类试剂盒测定，分泌的单抗都属于迫G1，Kappa型。4．以抗D

5、ES和抗DIEN单克隆抗体为基础，分别优化了包被原和抗体工作浓度、包被条件、封闭时间、抗体反应时间、缓冲液pH、离子强度等条件，建立了DES和DIEN间接竞争ELISA方法，其中DES在0．3"-'3n∥IIll呈线性关系，ICso为1．0ng／nm，检测限(LoD)为0．065ng／ml，定量限(LOQ)为0．15ng／ml，与己烷雌酚(HEX)和DIEN的交叉反应为7．7％和1．3％，与1713一雌二醇无交叉反应。DIEN在1"30ng／n：1l呈线性关系，ICso为5．4ng／n11，LOD为0．16ng／ml，LOQ为0．24ng／ml，与HEX、

6、DIEN和1713一雌二醇均无交叉反应。5．将DES和DIEN分别添加至鸡肉中进行同收率测定，结果显示DES回收率为71％一107％，DIEN的同收率为62％一64％。以此方法测定了随机采集的16份鸡肉样本，结果均未发现有DES和DIEN超标。为了进一步验证方法的可靠性，与进口试剂盒进行了比对试验，结果显示此法与进口试剂盒的回收率和变异系数相近；进口试剂盒测定的16份随机鸡肉样品，结果显示全部呈阴性。目前，我国国家标准中对DES和DIEN残留检测的确证方法(LC—MS／MS)的检测限为l¨g，l(g，表明建立的DES和DIEN的ELISA方法能满足动物性食

7、品残留检测的要求。关键词：己烯雌酚，双烯雌酚，半抗原合成，多克隆抗体，单克隆抗体，酶联免疫吸附试验ⅡAbstractDiethylstilbestrol(DES)andDienestrol(DmN)arenon—steroidal，syntheticestrogen．Theyhavebeenusedintheareaofanimalhusbandryasgrowthpromotingagentsfordecadesforitspositiveinfluencesoneconomicallyimportanttraitssuchasgrowthrate，le

8、anmeatrateandfeedefficiency．Dueto