mrl-lpr小鼠肾组织mcpl表达及mmf对其表达的影响和相关机制研究

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1、MRL/lpr小鼠肾组织MCPl表达及MMF对其表达的影响和相关机制研究【摘要】目的：检测MRL/lpr狼疮小鼠肾组织单核细胞趋化蛋白1（MCP1）表达及探讨霉酚酸酯（MMF）对其影响和相关机制，研究MMF对MRL/lpr狼疮小鼠的治疗作用。方法：MRL/lpr狼疮小鼠分为对照组和治疗组两组。观察肾组织病理学改变及其MCP1、CD14和蛋白激酶C（PKC）等的表达以及尿蛋白、抗dsDNA抗体水平的变化。结果：对照组小鼠肾小球基底膜增厚，系膜基质增多，肾组织MCP1表达上调，CD14+细胞数明显增多，伴尿蛋白及抗ds

2、DNA抗体水平增加。治疗组小鼠肾组织MCP1表达减少，CD14+细胞数减少，尿蛋白和抗dsDNA抗体水平减少，且肾小球MCP1与其PKC表达水平及肾小球CD14+细胞数、尿蛋白水平呈直线相关关系。结论：MMF对MRL/lpr小鼠自发狼疮肾炎具有治疗作用，其机制可能通过抑制PKC通道激活减少小鼠肾组织MCP1的表达，从而减少肾组织单核细胞的浸润，减轻肾脏损害。【关键词】单核细胞趋化蛋白1；狼疮肾炎；霉酚酸酯；蛋白激酶C；小鼠近来研究发现单核细胞趋化蛋白1(monocytechemoattractantprotein

3、1,MCP1)是一种特异性的单核细胞趋化因子，能活化单核细胞并趋化其在肾脏聚积，还可以通过上调某些β2整合素的表达，使单核细胞的黏附增强，参与肾脏的损害［1］。国内研究发现狼疮肾炎(lupusnephritis,LN)患者肾小球内MCP1表达与尿蛋白水平及单核细胞浸润的数量相关［2］，我们已报道LN患者尿MCP1水平与疾病的活动性明显相关［3］。免疫抑制剂霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)抑制嘌呤合成的起始途径，选择性地抑制T、B淋巴细胞增生，初步临床研究［2］证明，MMF对难治性Ⅳ型LN患者

4、具有满意的疗效，可使患者肾功能改善，蛋白尿、血尿明显减少，体液免疫亢进得到抑制，肾脏活动性病变减轻。但MMF是否通过下调肾组织MCP1表达而发挥其肾脏保护作用尚不清楚。本实验利用MRL/lpr自发狼疮小鼠探讨了MCP1产生的相关机制，并观察了MMF对LN肾组织MCP1表达的影响及对狼疮小鼠的治疗作用。1材料和方法1.1实验材料MRL/lpr小鼠(12只，雌性，3月龄,购自中国科学院上海实验动物中心)，羊抗小鼠MCP1多克隆抗体(由美国俄亥俄州立大学医学和卫生学院Rovin教授惠赠)，羊抗小鼠CD14多克隆抗体(邦定泰克

5、，抗单核/巨噬细胞)，羊抗小鼠蛋白激酶C（PKC）多克隆抗体(武汉博士德公司，浓缩型)，MMF胶囊(上海罗氏公司惠赠)。1.2实验动物分组MRL/lpr小鼠体重20～30g，随机分成对照组和治疗组两组，每组6只，饲以普通饲料。其中对照组予MMF同体积的0．5％羧甲基纤维素水灌胃；治疗组予含MMF(90mg·kg-1·d-1)的0．5％羧甲基纤维素水灌胃，治疗3个月。于实验前及结束时取眶后静脉血，留取血清冻存备测，每两周留取24h尿蛋白量备测，实验结束时处死动物，肾脏予冰生理盐水灌洗后分别予甲醛、戊二醛固定待测。1.3尿蛋白测定

6、采用考马斯亮蓝法测定其蛋白含量。1.4血清抗dsDNA抗体的测定采用ELISA法测定血清抗dsDNA抗体。主要步骤如下：96孔酶标板每孔加入100μldsDNA抗原包被液进行包被，后予1％牛血清白蛋白封闭24h，依次加入按1∶50稀释的小鼠血清，1∶1000稀释的羊抗小鼠IgGHRP，每次均37℃孵育1h，用OPD底物显色液显色，分光光度计检测其A492nm值。1.5肾组织常规病理学分析甲醛固定的肾组织，经石蜡包埋，4μm厚切片，分别进行HE和PAS染色。肾组织病理定量分析：（1）HE染色片，随机选取5个肾小球，计算每

7、个肾小球中细胞个数。（2）肾小球系膜基质增生半定量分析，采用北京航空航天大学计算机医学病理图像分析系统肾小球分析模块，取PAS染色切片，每张切片观察5个正切肾小球，计数肾小球系膜区面积占整个肾小球面积的百分比。（3）肾小管间质半定量分析,取PAS染色切片，每张切片观察5个不含肾小球的皮质视野，计数肾间质面积占整个视野的百分比。1.6肾组织MCP1、CD14及PKC免疫组化检查石蜡切片常规脱蜡至水，3％H202封闭，微波修复抗原5min×2次，间隔5～10min，蒸馏水漂洗，正常山羊血清室温封闭20min；加入Ⅰ抗(羊抗小鼠M

8、CP1、CD14及PKC多克隆抗体)，37℃孵育20min，PBS漂洗，加入Ⅱ抗(辣根过氧化酶标记的兔抗羊IgG)，37℃孵育20min，PBS漂洗；加入DAB室温显色10min，蒸馏水漂洗；1％盐酸乙醇分化20s，脱水、透明、封片，显微镜观察。1.7MCP1、PKC及C