ppgalnact2反义rna对胃癌细胞sgc7901生物学特性的影响

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1、ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的影响：金美芳，邵雪军，吴士良【摘要】目的：研究人胃癌细胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAcT2)基因表达与肿瘤转移相关基因MMP2，TGFβ1表达的相关性，以及对细胞增殖和形态生物学特性的影响。方法：用两个已构建好的反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901，通过Ｇ418筛选，建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆。通过共聚焦显微镜，RTPCR检测反义封闭ppGalNAcT2基因RNA表达后，胃癌细胞SGC7901中TGF

2、β1，MMP2表达水平，细胞增殖以及形态的变化。结果：反义封闭ppGalNAcT2基因表达后,胃癌细胞SGC7901ppGalNAcT2的表达水平明显降低，细胞的形态发生改变，分裂增殖减慢。结果还显示，反义封闭ppGalNAcT2基因表达可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表达水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响。结论：ppGalNAcT2可能在肿瘤的增殖、浸润和转移中发挥作用。【关键词】SGC7901细胞；多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶;基质金属蛋白酶;转化生长因子β1［Abstract］

3、Objective:TostudytheeffectonthecellproliferationandthelevelofMMP2andTGFβ1intheSGC7901cellscausedbyantisenseblockingppGalNAcT2geneexpressionMethods：TheantisenseexpressingvectorsoftentsingatblockingofppGalNAcT2geneexpressionofSGC7901cellsicroscopy.ThentheexpressionofppGalNAcT2，MMP2

4、andTGFβ1genecellsgroRNAandproteinlevelofMMP2andTGFβ1.Conclusion：TheresultsuggeststhatppGalNAcT2hasanimportantroleinthecellproliferation,invasionandmetastasisofcancer.［Keyinyltransferase;matrixmetalloproteinase;transforminggroinyltransferase，ppGalNAcTs）是O糖链合成第一步的糖基转移酶，ppGalNAcT2

5、是该家族中组织分布及底物谱较广的成员，很有可能是O糖链合成的限速酶，有着重要的生物学意义［2］。为了深入研究ppGalNAcT2的生物学功能，我们成功地构建了ppGalNAcT2反义表达质粒载体，反义封闭ppGalNAcT2基因表达［3］；我们也成功地构建了ppGalNAcT2的RNA干扰真核表达载体，转染SGC7901细胞得到稳定的ppGalNAcT2基因剔除细胞株［4］。为探讨ppGalNAcT2在肿瘤细胞生长增殖及浸润转移中的作用，本研究将ppGalNAcT2反义重组载体运用脂质体介导转染人胃癌细胞SGC7901，得到封闭胃癌细胞S

6、GC7901细胞ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆，并对其生长繁殖及浸润转移相关基因基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）和转移生长因子β1（transforminggroega公司，转染试剂盒G418选择性抗生素购于Roche公司。PCR引物为上海博亚公司合成。NBT/BCIP染色试剂盒为华美生物工程公司产品，antihTGFβ1、antihMMP2及βactin单抗均为RD公司产品。1.2方法1.2.1重组质粒转染SGC7901细胞pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重组载体分别是将T2全长序列1716b

7、p和T2序列中的一片段753bp经酶切后反向连接入pEGFPC1载体中，分别形成反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。转染前将SGC7901细胞接种于24孔板，加入不同浓度的G418观察细胞的死亡情况，确定最低致死浓度。将处于对数生长期的SGC7901细胞接种于培养瓶(1×106/ml)，于37℃，5％CO2孵箱中孵育12h后，按FUGENE6介导转染贴壁细胞的方法，将纯化的重组质粒和阴性空质粒转染SGC7901细胞。72h后加入G418溶液至终浓度为600mg/L，培养2周左右直到出现抗G418细胞克隆。1.2.2共聚焦显微镜观