vegf165反义rna表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

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1、VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响　　摘要:目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子，vascularendothelialgrom3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363）mm结论VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长，另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.　　Keyachneoplasms;vascularendothelialgroangastriccancercellsbyantisensenucleotidetechni

2、que.METHODSTheVEGF165antisensegenerebinanticeoftransfectedcellsined.RESULTSIntroductionoftheVEGF165antisenseconstructintoSGC-7901cellsresultedinamarkedreductionintheexpressionofVEGF-specificmRNAandproteinbydotblotandimmunofluorescencestaininganalysisintransf

3、ectedtumorcells.Cellcycleanalysisshoberoftrans-fectedcellshadanincrease（0.39）inG2/Mphase，adecrease（0.54）inSphase，anditscolonyformingrate（2.2%）eoftumor（345±136）mm3inthenudemiceinoculatedm3inthenudemiceinoculatedightinhibitthegroor;inaddi-tion，itmightcorrelate

4、orcells.　　0引言　　血管形成与肿瘤的发生、生长、转移及预后有密切的关系.目前治疗肿瘤的各种药物主要是针对肿瘤细胞本身进行的，但恶性肿瘤生长和转移的血管依赖性提示，通过抑制肿瘤新生血管形成可以防治肿瘤的生长与转移，开辟治疗肿瘤的第二战场［1，2］.我们拟采用VEGF/VEGFR为靶点进行反义核酸抗肿瘤治疗，主要基于以下考虑:①VEGF是一个强有力的血管内皮细胞促分裂因子，并能增加毛细血管的通透性.许多实体肿瘤组织细胞均高水平表达VEGF［3-5］，且表达量与肿瘤的恶性程度正相关.正常组织中仅肾、卵巢等少

5、数脏器有较高水平的表达［6，7］.胃肠道肿瘤以外的正常上皮、增生性息肉、腺瘤则未见VEGF及其受体的表达［8］;②虽然发现至少有十四种生长因子具有刺激新生血管形成的作用，但只有VEGF专一作用于血管内皮细胞，而且现已发现有许多生长因子，如TGF-β刺激新生血管形成的作用是全部或部分通过诱导VEGF表达而实现的;③已有研究用VEGF单克隆或多克隆抗体有效抑制新生血管形成和肿瘤生长的报道.　　1材料和方法　　1.1材料　　限制性核酸内切酶、无DNA酶的Rnase购自Promega公司，LipofectAmine由G

6、ibco公司提供.G418由Sigma公司提供.RNA地高辛标记试剂盒（SP6/T7）购自BoehringerMannheim公司.FITC标记的羊抗兔IgG由Vector公司提供.人胃癌细胞系SGC-7901、宿主菌E.coliDH5α等均为本校全军消化性疾病研究所保存.含有605bp的VEGF165cDNA基因被克隆在pGEM-3Zf（+）的BamHI位点质粒pGEM-hVEGF由美国加利福尼亚大学医学院癌症研究所Abraham教授惠赠;pcDNA3真核表达载体由本校生物化学教研室柴玉波博士惠赠.根据质粒图

7、谱，将EcoRI+HindIII消化pGEM-hVEGF后得到的VEGF165cDNA反向克隆至由此两种酶消化后的pcDNA3中，成功构建了反义RNA表达质粒-pcDNA-as-hVEGF.BALB/c裸小鼠由本校实验动物中心提供并饲养.　　1.2方法　　1.2.1VEGF反义基因转染及转染细胞的鉴定　　SGC-7901细胞在含100mL・L-1小牛血清的完全RPMI1640培养基中贴壁生长，37℃，50mL・L-1CO2条件下培养，以2.5g・L-1胰酶消化传代.在6

8、孔板中接种指数期生长的细胞，过夜培养，直至细胞50%汇片.用无血清RPMI1640液洗涤后，将DNA/Liposome复合物及无血清RPMI1640液加入待转染细胞孔中，5h后加入含200mL・L-1小牛血清的完全RPMI1640培养液.培养48h后传代于含350mg・L-1的G418选择培养液，挑选G418抗性克隆并扩增培养作进一步鉴定.①PCR分析，取V