创伤性脑损伤后尼莫同对aqp4表达和血脑屏障通透性的影响

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1、创伤性脑损伤后尼莫同对AQP4表达和血脑屏障通透性的影响【关键词】脑损伤;尼莫同;AQP4;血脑屏障;大鼠　　[ABSTRACT]Objective:ToexploreeffectofNimodipineonexpressionofAQP4andpermeabilityofbloodbrainbarrier(BBB)aftertraumaticbraininjury.Methods:MadeseveretraumaticbraininjurymodeoforphologicalobservationafterHEstain;(2)Immunohistologicalexper

2、imentfortestingexpressionofAQP4;(3)DeterminationofEBincerebralinjurytissuetoobservethepermeabilityofBBB.Results:Afterbraininjury,pathologicalvariation,upregulationofAQP4expression,increaseofBBBpermeabilityoccurredinischemictissuebothofNimodipinegroupandcontrolgroup.Besides,thelongertheinju

3、rylasted,themoreseverethesepathologicalvariations12h(P<0.05).Conclusion:NimodipinecanincreasepermeabilityofBBB,andhasnoeffectonexpressionofAQP4.　　[KEYedipine;AQP4;Bloodbrainbarrier;Rat　　细胞内钙超载在创伤性神经损害中起重要作用。脑损伤(TBI)后Ca2+浓度升高，激活多种磷酸酶，促使膜磷脂分解，细胞膜及细胞器膜结构均受到损害，膜磷脂降解产物增多，进一步加重细胞功能紊乱。钙超载可以增强Ca

4、2+依赖性蛋白酶的活性，促进氧自由基的生成。钙离子拮抗剂能够抑制细胞外Ca2+的内流，减少细胞内结合Ca2+的释放，阻止胞浆内游离Ca2+浓度的升高，减轻神经细胞损伤;使痉挛的血管扩张，改善创伤区的血流和代谢，现在临床上广泛使用的钙离子拮抗剂是尼莫地平[1，2]。为此我们选择在脑损伤后应用钙离子拮抗剂尼莫同(nimotoping)(尼莫地平注射液)，观察尼莫同在脑损伤后对AQP4表达和血脑屏障(BBB)通透性的影响，探讨在脑损伤后应用钙离子拮抗剂对脑的作用。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物和分组健康g/kg体重)，然后每12h给药1次。对照组在相应时间点给

5、予相同剂量的生理盐水。每组分为TBI后4h、8h、12h、1d、3d、5d和7d七个亚组。每个亚组均选取大鼠5只。　　1.1.2主要试剂和仪器尼莫同：尼莫地平注射液(德国拜尔公司生产)，伊文思兰和甲酰胺(Sigma公司)，兔抗鼠AQP4单克隆抗体(SantaCruz公司)，SABC法免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。　　1.2实验方法　　1.2.1动物模型的制作采用改进Feeney's[3]自由落体硬膜外撞击方法致局灶性重度脑创伤模型(40g×25cm)。SO组：除不予以撞击外，其余操作与TBI组相同。于伤后4h、8h、12h、1d、3d、5d和7d处死动物

6、，留取标本待检测。　　1.2.2免疫组化检测AQP4的表达在各相应时间点经心脏用4%多聚甲醛(PFA)作预固定，迅速打开颅腔取出完整的大脑，放入4%PFA中后固定24h。然后常规进行石蜡包埋，作连续5μm切片。用于HE染色形态学观察，并按常规SABC法进行免疫组化检测AQP4的表达。阴性对照：用PBS代替一抗。　　1.2.3EB荧光法测定创伤区脑组织BBB通透性　　(1)标准曲线制作：称取4mgEB于容量瓶中，加生理盐水至总容量为25mL，取0.3mL加入5.7mL甲酰胺中混匀作为第1管;从第1管中取3mL加入3mL甲酰胺中作为第2管;将第2管溶液对半稀释作为第3管;依此类推

7、共作6管，其浓度依次为8.0，4.0，2.0，1.0，0.5，0.25μg/mL，37℃水浴卵育48h后比色(λ=632nm)，测定光密度，制作标准曲线。　　(2)伊文氏蓝(Evansblue,EB)含量的测定：各组动物均于处死前1h注射2%伊文氏蓝3mL/kg。断头取脑组织，将其放入培养皿中，以防水分蒸发。取损伤区中心脑组织100mg左右，称重后放入存有3mL二甲基甲酰胺的试管中，60℃水浴中(避光)抽提24h。1500g离心10min，取上清，应用RF540荧光分光光度计(λ=632nm)测定EB