白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究

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1、白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究：卓佳，陈柏坤，黄慧燕，徐瑜，张洪勤【摘要】　　目的：了解白色念珠菌的基因分型情况以及不同基因型白色念珠菌的药敏试验结果。方法：应用聚合酶链反应（PCR）扩增白色念珠菌25S核糖体DNA基因内含子区，可转座I型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同，根据产物片段大小和数目分型。采用K-B法对不同基因型进行白色念珠菌药敏分析。结果：临床分离的121株白色念珠菌经PCR分为三型：A型83株，B型27株，C型11株。A型为最常见的基因型，B型、C型白色念珠菌对

2、唑类抗真菌药物的耐药率显著高于A型菌株，对其他抗真菌药物的耐药率差异无显著性。结论：不同型别的白色念珠菌耐药谱可能与特定基因型有一定相关性。【关键词】白色念珠菌PCR基因分型药敏分析　　Abstract:Objective:TounderstandthesituationofgenotypeandtheresultofdrugsusceptibilityofCandidaalbicansisolated.Methods:Polymerasechainreaction(PCR)designedtosp

3、antheregionthatincludedthesiteofthetransposablegroupIintronof25SrDNAofCandidaalbicansentsinthe25SrDNAethodsaingenotype.Theresultsoftheantifungalsusceptibilitytestingshooreresistantforazole-drugsthanstrainsofgenotypeA，nosatisticallydifferenceongotherant

4、ifungaldrugs.Conclusion:differenttypesofresistancespectrumforCandidaalbicansmayhaveacertainrelevancetoitsspecificgenotypes.　　KeyL美兰的M-H琼脂培养基、YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0（自制）；2%蜗牛酶；原生质缓冲液：1mol/L山梨醇，0.02mol/L柠檬酸，0.02mol/L磷酸氢二钠

5、，pH5.8；SE缓冲液：1mol/L山梨醇，0.0625mol/LEDTA，pH8.0；丹麦ROSCONeo-Sensitab抗真菌药敏纸片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，两性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕贸易有限公司提供；PCR使用试剂，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技术服务有限公司产品；梯度PCR仪（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝胶成像

6、及分析系统（gel-Doc2000美国）。　　1.3菌株的分离鉴定　　标本按常规方法分离培养，对临床怀疑真菌感染的标本接种沙保弱培养基，将分离到的酵母样真菌接种于科玛嘉显色培养基，37℃孵育48h，根据生长菌落的颜色作出鉴定，绿色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，蓝色菌落是热带念珠菌。　　1.4白色念珠菌DNA的提取　　取沙保弱平板纯培养的单个菌落接种于YEPD培养基中，35℃震荡培养过夜。2000r/min离心10min，弃上清液。三蒸水洗2次。菌体加600μL2%蜗牛酶溶于原生质缓冲液，

7、30℃水浴2h。3000r/min离心10min，弃上清液。SE缓冲液400μL悬浮细胞。3000r/min离心10min，弃上清液。沉淀加入450μLTE缓冲液，10%SDS50μL，65℃水浴30min。加200μL5mol/L乙酸钾，冰浴1h。12000r/min离心5min，取上清液，加等体积无水异丙醇，混匀，-20℃静置20min。12000r/min离心20min，弃上清液。加70%无水乙醇500μL，混匀，12000r/min离心5min，弃上清液，自然干燥，溶解于50μLTE缓冲液，

8、-20℃保存。　　1.5白色念珠菌基因分型　　采用特异引物扩增白色念珠菌基因组DNA的25SrDNA基因的内含子区，以内含子大小及其中可转座I型内含子片段的缺失或插入作为分型依据[2]。一对分型引物P1、P2分别位于可转座内含子的两翼。　　P1：5’-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3’（up），30mer，　　P2：5’-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3’(doer；　　PCR反应总体积30μL，含Taq