不同地区孢子丝菌临床分离株基因分型及药物敏感性研究

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1、不同地区孢子丝菌临床分离株基因分型及药物敏感性研究GenotypingandantifungalsusceptibilityresearchofSporothrixschenckiiisolatesfromdifferentregionsofChina作者姓名：石滢专业名称：皮肤病与性病学指导教师：李珊山教授学位类别：医学硕士答辩日期：2015年5月26日前言孢子丝菌病（sporotrichosis）是由双相型申克孢子丝菌（Sporothrixschenckiisensulato）引起的人畜共患的深部真菌病，常侵犯皮肤、皮下组织及邻近淋巴系统，严重

2、时可播及内脏器官。申克孢子丝菌常经破损的皮肤、粘膜等植入感染，也可经呼吸道传播。其广泛存在于自然界，如腐烂的坑木、草炭、芦苇、木材、玉米杆、玉米棒等，并在世界范围内广泛分布，至今我国各省、市、自治区均有本病报道，其中以黑龙江省、吉林省，南方以江苏省、广东省、广西壮族自治区等报道较多。近年来，相关研究者从分子生物学和形态学的角度对申克孢子丝菌进行了重新分类。有研究表明，中国地区的孢子丝菌可能主要为球形孢子丝菌（S.globosa）。一直以来，人们主要致力于申克孢子丝菌这一单一菌种的研究，针对其药物敏感性也进行了大量研究，发现国内外不同地区菌株的药敏结

3、果显示出较大差异，进一步证实了申克孢子丝菌可能存在多个菌种，药物敏感性可能存在种内差异，但是少有对中国地区申克孢子丝菌进行菌种鉴定，比较其药物敏感性的试验报道。本研究将近年来收集的不同地区的孢子丝菌临床分离株，进行CAL基因测序和系统进化分析，研究孢子丝菌基因分型与地区分布及药物敏感性的关系，旨在为解析孢子丝菌病的致病机制及合理用药提供理论依据。I中文摘要不同地区孢子丝菌临床分离株基因分型及药物敏感性研究目的：对我国不同地区孢子丝菌的临床分离株进行基因分型和系统进化分析；研究双相型真菌球形孢子丝菌分别在菌丝相（30℃、35℃）和酵母相（35℃）两种

4、形态下对8种抗真菌药物的敏感性，了解不同地区球形孢子丝菌的药物敏感性是否有差异。方法：1、分别选取吉林省、广东省、四川省、北京市、江苏省地区球形孢子丝菌株共5株，分别采用CTAB法、异硫氰酸胍沸腾法、碱裂解法、试剂盒法提取DNA，检测其核酸浓度及纯度值，并利用PCR扩增，比较产物条带亮度，确定孢子丝菌DNA最佳提取方法。2、对43株临床分离株的钙调蛋白基因（CAL)进行核酸测序，并将其序列在Genbank数据库上比对，利用MEGA5.0软件，采用邻接法（neighbor-joining，NJ）进行系统进化分析。3、采用美国临床和实验室标准化研究所（

5、CLSI）制定的微量液基稀释法M-38A和M27-A2，并稍作修改后，对43株经鉴定为球形孢子丝菌菌株的两种形态（菌丝相及酵母相）在不同温度（30℃、35℃）进行体外药物敏感试验，测定的抗真菌药物为：氟康唑、伊曲康唑、特比萘芬、酮康唑、益康唑、伏立康唑、咪康唑、两性霉素B。计算其最小抑菌浓度（MIC），MIC50、MIC90、GM，利用统计学软件比较其差异性。结果：1、比较CTAB法、异硫氰酸胍沸腾法、碱裂解法、试剂盒法四种方法所提取的球形孢子丝菌的DNA，结果显示碱裂解法提取的DNA纯度最好。2、使用CL1，CL2A引物对43株临床孢子丝菌基因组

6、DNA扩增后可获得约770bp左右大小的CAL基因片段，经序列测定和比对后，确定43株临床分离孢子丝菌均为球形孢子丝菌。系统进化树结果显示，各地区球形孢子丝菌与文献II已确证的球形孢子丝菌（AM399002、AM39004、AM399005、AM399015、KC190217、KC121565、KC190218、KC190219、AM399015、GU456632）位于同一group中，且分为两个cluster，推测球形孢子丝菌可能存在两个亚组。3、体外双相不同温度药物敏感性试验结果：（1）TBF抗真菌活性最好，MIC值0.03-0.25μg/ml

7、，GM值为0.04μg/ml，其次为MCZ、ECZ和KCZ的抗真菌活性较好，MIC值分别为0.03-1.0μg/ml、0.03-1.0μg/ml、0.03->4.0μg/ml，但是不同温度及不同时相MIC值稍有波动;（2）统计学结果显示，不同地区药敏结果差别均无统计学意义（P>0.01）。菌丝相不同温度（30℃、35℃）及酵母相35℃MIC值差别有统计学意义（P<0.05），菌丝相的MIC值较酵母相的高，其中MIC值菌丝相35℃介于菌丝相30℃和酵母相之间。结论：1、碱裂解法是一种适于球形孢子丝菌DNA提取的简便方法。2、中国各个省市地区均以球形孢

8、子丝菌为主要致病菌种，多数来源于环境，球形孢子丝菌的基因型别无明显地区差异。3、不同地区球形孢子丝菌对TBF最为敏感，其次