白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究论文

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1、白色念珠菌临床株基因分型及耐药性研究论文卓佳，陈柏坤，黄慧燕，徐瑜，张洪勤【摘要】目的：了解白色念珠菌的基因分型情况以及不同基因型白色念珠菌的药敏试验结果。方法：应用聚合酶链反应（PCR）扩增白色念珠菌25S核糖体DNA基因内含子区，可转座I型内含子插入片段的数目及大小的不同使得扩增产物不同，根据产物片段大小和数目分型。采用K-B法对不同基因型进行白色念珠菌药敏分析。结果：临床分离的121株白色念珠菌经PCR分为三型：A型83株，B型27株.freelerasechainreaction(PCR)designedtospantheregionthatincludedth

2、esiteofthetransposablegroupIintronof25SrDNAofCandidaalbicansentsinthe25SrDNAethodsaingenotype.Theresultsoftheantifungalsusceptibilitytestingshooreresistantforazole-drugsthanstrainsofgenotypeA，nosatisticallydifferenceongotherantifungaldrugs.Conclusion:differenttypesofresistancespectrumfor

3、Candidaalbicansmayhaveacertainrelevancetoitsspecificgenotypes.KeyL美兰的M-H琼脂培养基、YEPD培养基(用于酵母原生质体融合)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，pH6.0（自制）；2%蜗牛酶；原生质缓冲液：1mol/L山梨醇，0.02mol/L柠檬酸，0.02mol/L磷酸氢二钠，pH5.8；SE缓冲液：1mol/L山梨醇，0.0625mol/LEDTA，pH8.0；丹麦ROSCONeo-Sensitab抗真菌药敏纸片：制霉菌素（NYS）50μg/片，氟康唑（FL）25μg

4、/片、酮康唑（KET）15μg/片，咪康唑（MTC）10μg/片，两性霉素B（AMB）10μg/片，伊曲康唑（IT）8μg/片，由杭州康裕贸易有限公司提供；PCR使用试剂，包括Taq聚合酶以及引物的合成，由上海生工生物工程技术服务有限公司产品；梯度PCR仪（Eppendorf公司）；Bio-RAD凝胶成像及分析系统（gel-Doc2000美国）。1.3菌株的分离鉴定标本按常规方法分离培养，对临床怀疑真菌感染的标本接种沙保弱培养基，将分离到的酵母样真菌接种于科玛嘉显色培养基，37℃孵育48h，根据生长菌落的颜色作出鉴定，绿色菌落是白色念珠菌，紫色菌落是近平滑念珠菌，蓝色菌

5、落是热带念珠菌。1.4白色念珠菌DNA的提取取沙保弱平板纯培养的单个菌落接种于YEPD培养基中，35℃震荡培养过夜。2000r/min离心10min，弃上清液。三蒸水洗2次。菌体加600μL2%蜗牛酶溶于原生质缓冲液，30℃水浴2h。3000r/min离心10min，弃上清液。SE缓冲液400μL悬浮细胞。3000r/min离心10min，弃上清液。沉淀加入450μLTE缓冲液，10%SDS50μL，65℃水浴30min。加200μL5mol/L乙酸钾，冰浴1h。12000r/min离心5min，取上清液，加等体积无水异丙醇，混匀，-20℃静置20min。12000r/

6、min离心20min，弃上清液。加70%无水乙醇500μL，混匀，12000r/min离心5min，弃上清液，自然干燥，溶解于50μLTE缓冲液，-20℃保存。1.5白色念珠菌基因分型采用特异引物扩增白色念珠菌基因组DNA的25SrDNA基因的内含子区，以内含子大小及其中可转座I型内含子片段的缺失或插入作为分型依据2。一对分型引物P1、P2分别位于可转座内含子的两翼。P1：5’-ATAAGGGAAGTCGGCAAAATAGATCCGTAA-3’（up），30mer，P2：5’-CCTTGGCTGTGGTTTCGCTAGATAGTAGAT-3’(doer；PCR反应总体积

7、30μL，含TaqDNA聚合酶0.2μL（1U），dNTP1.5μL，引物P1、P2各1μL。扩增程序：预变性94℃3min；94℃1min，60℃40s，72℃1min，共30个循环；72℃延伸10min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。1.6药敏试验吸取一定量的0.5McFland菌悬液用生理盐水1:1稀释。以无菌棉拭子蘸取稀释后的菌悬液从3个方向分别均匀接种于含2%葡萄糖和0.5μg/mL美兰的M-H琼脂培养基上，室温静置5～15min，用无菌镊子将药敏纸片贴于琼脂表面。室温置15min后转入35℃恒温培养箱培养18～24h（