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1、结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析论文【摘要】探讨四川地区结核患者结核分枝杆菌基因分型及其与耐药性关系。方法采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点进行检测,并应用Gel-Proanalyzer3.0软件和BioNumerics(Version3.0)软件对检测结果进行基因型分析,同时分析其基因型与耐药之间的关系。结果124株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型,成簇基因型占74.19%（92/124），单一基因型占25.81%（32/124）。耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学差异。结论四川地
2、区结核患者的结核分枝杆菌具有明显的基因多态性，成簇类型是主要流行菌株，应加强流行结核菌株的监控。【关键词】结核结核分枝杆菌基因分型Abstract：ObjectiveTostudyongenotypingofMycobacteriumtuberculosis(MTB)isolatesandtoanalysistherelationbetbertandemrepeat(VNTR)inSichuanarea.MethodsSixtandemrepeatlociofthe124isolatesofM.tuberculosisinSichuanarea
3、erics3.0softorphismintheM.tuberculosisisolatesinSichuanarea.Andtheclusteringtypeainepidemicstrains.Itissuggestedthatsurveillanceoftheepidemicgenotypetobestrengthened.Keytuberculosis;genotyping结核病仍然是一种严重危害人类健康的重大传染性疾病，特别是耐药结核分枝杆菌的发生和流行，给结核病的治疗、预防和控制带来巨大困难。目前，随着分子生物学的发展，可变数目串联
4、重复(variablenumbertandemrepeat.freelin，快速离心,取上清备用。1.5重复位点的选择参照文献国内外报道［1～5］,依据其多态性分析结果,确定了6个串联重复基因位点,其中包括3个ETR(exacttandemrepeat)位点和3个MPTR(majorpolymorphictandemrepeat)位点(见表2-2)。实验中以标准测序株H37Rv为对照并以其实验结果获得相对分子质量大小。1.6VNTR-PCR采用25ulPCR反应体系。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶恒电压(10v/cm)电泳,.freell)分别为
5、0.2,40.0,2.0,10.0.耐药标准:含药培养基菌落数/对照培养基菌落数≥1%为耐药。1.8结果判定以参照菌株H37RV拷贝数为参考，根据待测样品６个位点的PCR扩增产物的大小(bp数)确定每个位点相应串联重复单元的重复次数,然后计算每个菌株相应位点的重复次数,即VNTR等位基因类型。根据VNTR方法获得的基因型确定分离株是成簇还是单一类型。基因型相同的分离株为成簇,而基因型与本研究中的其他任何分离株均不匹配则为单一基因型。1.9统计软件BioNumerics(Version3.0)统计分析软件；SPSS（12.0）统计软件包。2结果2
6、.1124株临床分离株的菌种鉴定结果采用鉴别培养基PNB和TCH对124株临床分离菌进行鉴定，根据菌株在培养基上生长情况来鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，结果显示124株临床分离株均为结核分枝杆菌。2.2124株结核分枝杆菌的药敏结果研究菌株通过培养基培养结果显示：完全敏感菌株（对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇均敏感）有92株，占74.19%（92/124），耐药菌株32株，占25.81%(32/124)。2.3124株结核分枝杆菌VNTR结果根据国外研究结果，本研究选取了8个基因位点，并对124株结核分枝杆菌进行VNTR检测
7、，以H37RV标准株作为对照，选取100bpDNAMarker作为分子量参照，其分子量从小到达依次为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp共11个分子量标准带。结果显示不同菌株的VNTRDNA指纹图谱在同一位点的扩增片段大小不同，不同菌株在不同位点的DNA指纹图谱也呈现出多态性，见图1～6.2.4不同菌株的VNTR位点的重复次数和位点的等位基因多态性根据不同菌株的VNTR指纹图谱，以H37Rv标准株为参考，对其他待检菌株的DNA条带进行选点，计算其
8、分子量的大小,然后计算出每个菌株在不同位点的重复次数。同时对分析124株结核分枝杆菌的6个基因位点的等位基因多态性，其结果显示：各位点呈现不同的等位基
