结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析

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1、结核分枝杆菌基因分型及其耐药性分析【摘要】探讨四川地区结核患者结核分枝杆菌基因分型及其与耐药性关系。方法采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,对124株结核分枝杆菌的6个可变重复位点进行检测,并应用Gel-Proanalyzer3.0软件和BioNumerics(Version3.0)软件对检测结果进行基因型分析,同时分析其基因型与耐药之间的关系。结果124株结核分枝杆菌共分为37个不同的VNTR类型,成簇基因型占74.19%（92/124），单一基因型占25.81%（32/124）。耐药菌株在成簇类型和单一类型的分布上存在统计学差异。结论四川地区结核患者的结核分枝杆菌具有明

2、显的基因多态性，成簇类型是主要流行菌株，应加强流行结核菌株的监控。【关键词】结核结核分枝杆菌基因分型Abstract：ObjectiveTostudyongenotypingofMycobacteriumtuberculosis(MTB)isolatesandtoanalysistherelationbetbertandemrepeat(VNTR)inSichuanarea.MethodsSixtandemrepeatlociofthe124isolatesofM.tuberculosisinSichuanareaerics3.0softorphismintheM.tu

3、berculosisisolatesinSichuanarea.Andtheclusteringtypeainepidemicstrains.ItissuggestedthatsurvEillanceoftheepidemicgenotypetobestrengthened.Keytuberculosis;genotyping结核病仍然是一种严重危害人类健康的重大传染性疾病，特别是耐药结核分枝杆菌的发生和流行，给结核病的治疗、预防和控制带来巨大困难。目前，随着分子生物学的发展，可变数目串联重复(variablenumbertandemrepeat，VNTR)分型技术由于

4、其操作方法简单，并能提供数字式的分型信息,具有很高的可重复性，在实验室内和实验室间具有非常好的可比性，可以同时对大量样本进行分析，因此，该技术广泛应用于结核杆菌的基因分型。所以，本研究通过对农村结核分枝杆菌基因分型和耐药性以及不同基因型与耐药性的相互关系研究，为我国结核分枝杆菌的分子流行学和结核耐药人群的监测提供重要的参考依据。1材料与方法1.1菌株来源临床菌株来源:124株结核分枝杆菌菌株由四川结核病防治所提供的结核患者的临床分离株；结核分枝杆菌标准菌株H37Rv购自中国药品生物制品检定所。1.2主要实验试剂TaqDNA聚合酶、dNTP、GoldViein，快速离心,

5、取上清备用。1.5重复位点的选择参照1.9统计软件BioNumerics(Version3.0)统计分析软件；SPSS（12.0）统计软件包。2结果2.1124株临床分离株的菌种鉴定结果采用鉴别培养基PNB和TCH对124株临床分离菌进行鉴定，根据菌株在培养基上生长情况来鉴别结核分枝杆菌、牛分枝杆菌和非结核性分枝杆菌，结果显示124株临床分离株均为结核分枝杆菌。2.2124株结核分枝杆菌的药敏结果研究菌株通过培养基培养结果显示：完全敏感菌株（对利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇均敏感）有92株，占74.19%（92/124），耐药菌株32株，占25.81%(32/124)

6、。2.3124株结核分枝杆菌VNTR结果根据国外研究结果，本研究选取了8个基因位点，并对124株结核分枝杆菌进行VNTR检测，以H37RV标准株作为对照，选取100bpDNAMarker作为分子量参照，其分子量从小到达依次为：100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp和1500bp共11个分子量标准带。结果显示不同菌株的VNTRDNA指纹图谱在同一位点的扩增片段大小不同，不同菌株在不同位点的DNA指纹图谱也呈现出多态性，见图1～6.2.4不同菌株的VNTR位点的重复次数和位点的等位基因多态性根

7、据不同菌株的VNTR指纹图谱，以H37Rv标准株为参考，对其他待检菌株的DNA条带进行选点，计算其分子量的大小,然后计算出每个菌株在不同位点的重复次数。同时对分析124株结核分枝杆菌的6个基因位点的等位基因多态性，其结果显示：各位点呈现不同的等位基因多态性，MTUB21位点的多态性最高，为0.575,ETR-B位点的多态性最低,为0.309,见表1.2.5菌株VNTR基因分型对124株M.TB菌株检测的6个VNTR位点的重表1各VNTR位点等位基因多态性表2成簇和单一基因型的耐药率比较表3成簇类型与单一类型与其他因素之间关系复次数采用Bi