survivinsirna真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌du145细胞的影响

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1、SurvivinsiRNA真核重组质粒的构建和鉴定及其对前列腺癌DU145细胞的影响：刘艳波葛贺卢丽莉赵雪俭【摘要】目的应用RNA干扰(RNAi)技术，构建针对凋亡抑制因子survivin的siRNA，并检测其对DU145细胞株内源性survivin基因和蛋白表达的影响。方法构建重组质粒shRNAsur1和sur2并分别转染DU145细胞株，通过半定量RTPCR和109为本中心保存;质粒pGCsiU6/Neo/GFP购自上海吉凯基因化学有限公司;各种分子克隆工具酶为TaKaRa产品，DNA纯化试剂盒、

2、RTPCR试剂盒、去内毒素质粒DNA小量提取试剂盒和小量DNA切胶回收纯化试剂盒为上海华舜生物工程有限公司产品;IMDM培养基为美国Hyclone公司生产，新生牛血清购自北京鼎国公司;转染试剂Lipofectamin2000购自Invitrogen公司，兔抗人survivin抗体及羊抗兔二抗购自SantaCruz公司，蛋白定量试剂盒为BioRad公司产品;其他试剂为进口或国产分析纯。DNA片段及序列测定均由上海生工生物公司完成。　　1.2方法　　1.2.1SurvivinsiRNA模板寡核苷酸设计按siRN

3、A设计原则，从GeneBank(NM001168)中寻找符合survivinmRNA特异靶序列，并用RNAstructure4.2软件对其二级结构进行预测,最终确定了两条DNA寡核苷酸链：(1)shRNAsur1针对其编码区166～184位碱基序列，其对应开放阅读框架序列为45～63;核苷酸序列为5′GATCCCGGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAGATGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTGGAT3′(正义)，5′AGCTATCCAAAAAGGACCACCGCATCTCTACA

4、TCTCTTGAATGTAGAGATGCGGTGGTCCGG3′(反义);(2)shRNAsur2针对其编码区394～412位碱基序列，其对应开放阅读框架序列为273～291，5′GATCCCGCAGTTTGAAGAATTAACCTTCAAGAGAGGTTAATTCTTCAAACTGCTTTTTGGAT3′(正义)，5′AGCTATCCAAAAAGCAGTTTGAAGAATTAACCTCTCTTGAAGGTTAATTCTTCAAACTGCGG3′(反义)每条正义链包括5′末端BamHⅠ酶切位点和反向

5、的两个一致的靶序列(19bp)，两个靶序列之间被9个非同源序列(TTCAAGAGA)所间隔。3′末端加有TTTTT以及HindⅢ酶切位点;同时设计对照质粒，5′GATCCGTATAAGTCAACTGTTGACTTCAAGAGAGTCAACAGTTGACTTATACTTTTTTGGAAA3′(正义)，5′AGCTTTTCCAAAAAAGTATAAGTCAACTGTTGACTCTCTTGAAGTCAACAGTTGACTTATACG3′(反义)由上海生工公司合成。　　1.2.2构建重组质粒pGCsilence

6、rU6siRNAsurvivin首先将pGCsilencerU6/Neo/GFP质粒用BamHⅠ及HindⅢ消化，凝胶回收pGCsilencer线性化片段(图1);将上述合成的正义和反义的寡聚核苷酸片段等比例混合后经过93℃变性3min后退火60min得到双链寡聚核苷酸片段，利用T4DNA连接酶分别与上述线性化表达载体连接，构建siRNA表达重组载体shRNAsur1和sur2。　　1.2.3细胞培养DU145细胞株常规培养于含10%新生牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的IMDM培

7、养液中,培养条件为37℃、CO2饱和度为5%,定期观察细胞生长情况,每2～3d用0.25%胰酶消化,进行传代培养。　　1.2.4转染细胞应用小量质粒提取试剂盒,提取去内毒素重组质粒shRNAsur1、sur2和scramble,并使用D(λ)值进行DNA定量。正常培养的DU145细胞融合至70%～80%时转染，用Invitrogen公司转染试剂LipofectamineTM2000进行转染。并分组为脂质体组、空质粒pGCsiU6/Neo/GFP、非特异对照组pGCsiscramble、pGCsisu

8、r1、sur2。除脂质体组外均按Invitrogen转染试剂盒说明进行操作置37℃培养，4～6h后加入含10%血清的IMDM培养液，置37℃培养,转染72h后收集细胞进行转染效率检测。　　M.DNAmarker;1.pGCsilencerU6/Neo/GFP;2.经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pGCsilencerU6/Neo/GFP　　图1pGCsilencerU6/Neo/