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1、饲料对异育银鲫消化道微生物物种组成的影响 肠道对于动物来说就像是内在生命线,而肠道内微生物影响着肠道众多功能的发挥,因此关于肠道内微生物的研究近几年也越来越被重视。已有研究表明,鱼类消化道微生物对鱼的免疫、营养等都有重要影响,消化道内微生物群落的平衡稳定可以促进鱼体健康的生长。鱼类消化道微生物在影响着宿主鱼的同时,其组成也受着宿主自身与外界因素的影响,Romero等发现银大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)消化道微生物群落在第一投喂阶段后才稳定,而李学梅等对室内养殖的斑点叉尾、银鲫和异育银鲫的消化道微生物进行了比较,发现不同种鱼的消
2、化道微生物的种类组成有显着差异,同时尹军霞等研究发现同种鱼消化道不同区段的微生物组成也存在很大不同,另外,Margolis早在1952年用传统培养法对经过饥饿处理的大头鱼(Ameiurusnebulosus)及斑点鳟(Salaelirutsfon-tinali)的消化道细菌进行了研究,发现饥饿使消化道微生物种类减少。以上研究表明消化道微生物与宿主鱼之间存在密切关系。对于外界条件变化,消化道微生物自身是否存在响应机制呢？本研究选用消化道微生物群落已相对稳定的异育银鲫中科3号成鱼作为研究对象,并将其消化道作为相对封闭的微型生态系统来研究,旨在进一
3、步阐述饲料这一鱼类营养源在作为消化道微生态系统外界干扰时对其内部物种组成的影响,为今后研究消化道微生物功能基因指明了方向,同时为水产鱼类肠道菌群研究提供一些基础数据。 1材料与方法 1.1实验材料与样品采集 实验鱼饲养于中国科学院水生生物研究所鱼类生理生态学学科组循环水系统中,水温为2428℃,期间投喂人工配合饲料,待性成熟后进行饥饿处理30d,随机抽取3尾同规格的鱼,在编号A、B和C后解剖取样,取样时用75%的酒精擦拭肠外壁,分前肠、中肠和后肠取样,取得9份样品分别编号H1-H9(H1、H2、H3代表A的前肠、中肠和后肠,H4-H6及
4、H7-H9对应代表B和C的前肠、中肠和后肠),保存用于微生物DNA的提取;再给剩下的鱼投喂相同人工配合饲料,25d后再次随机抽取3尾同规格的鱼编号D、E和F,解剖取样得9份样品,分别编号F1-F9(F1、F2、F3代表D的前肠、中肠和后肠,F4-F6及F7-F9对应代表E和F的前肠、中肠和后肠),保存用于微生物DNA的提取。 1.2消化道微生物总DNA的提取 实验采用传统的酚-氯仿法提取肠道微生物总DNA,即:向每管样品中加入1.2mL裂解液(0.5%SDS;10mmol/LTris-Cl,pH8.0;10mmol/LEDTA,pH8
5、.0;100mmol/LNaCl;蛋白酶K100μg/mL;RNaseA,50μg/mL),37℃水浴1h后,加入PK(20mg/mL)6μL,55℃过夜(12h,至清亮);取上清液进行DNA抽提,DNA在4℃下经24h沉淀后,离心干燥并加入100mL无菌水溶解,–20℃保存备用;总DNA用0.7%的琼脂糖凝胶(含EB)进行电泳以检测提取效果。 1.3PCR-DGGE分析 采用细菌16SrRNA基因V3区通用引物(F357-GC和R518)对所得18个样品中的肠道细菌DNA进行PCR扩增,将扩增得产物进行DG
6、GE分析,变性剂浓度范围为40%70%,凝胶在110V下经过12h的电泳后紫外照相,由于投喂组F5和F6未能得到相应的PCR扩增产物,样品F5和F6不参与数据分析,使用QuantityOne(Bio-RadLaboratories,CA,USA)软件对谱带进行分析。 1.4数据分析 在得到各泳道及谱带亮度等详细信息并转化为0/1矩阵后,使用Canoco4.5对数据进行CA(Cor-respondenceAnalysis)分析,通过R3.0.0对各泳道数据进行基于Jaccard指数的相似性分析并绘制聚类图,通过MicrosoftExcel2
7、010对谱带数量及亮度值进行分析并绘图,同时计算谱带亮度值的方差值以比较两组中各物种分布密度的变异程度大小。 2结果 2.1消化道微生物群落PCR-DGGE指纹分析 针对细菌16SrRNA基因进行的PCR-DGGE指纹分析共检测到23条不同的谱带(图1),其中饥饿组谱带数为18条,投喂组谱带数为17条,两组共有谱带12条,由图上可以看出饥饿组特异性谱带稳定且与投喂组存在明显差别,以实验鱼为操作单元，基于全肠微生物种类分布的相似性聚类分析表明(图2),饥饿组A、B和C聚为一枝,D、F聚为一枝。【图略】 2.2消化道微生物群落结构相似
8、性 CA结果显示除样品F9外,投喂组(F1-F4,F7,F8)与饥饿处理组(H1-H9)消化道存在明显差异,投喂组样品主要存在于第二、三象限,饥饿组主要存在于第一
