白细胞抑制因子对鼠急性肺损伤时白细胞的影响

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1、白细胞抑制因子对鼠急性肺损伤时白细胞的影响摘要:为探讨白细胞抑制因子(NIF)转基因后在鼠急性肺损伤时肺内、循环静脉血中白细胞的影响。本实验采用阳离子脂类，NIF基因重组法，用脂多糖(LPS)致鼠急性肺损伤，分组测定静脉血及肺泡内白细胞的变化。结果发现LPS诱发急性肺损伤后2h静脉血中白细胞明显减少(P＜0.01)，在肺泡灌洗液内中性粒细胞明显增多(P＜0.01)。而采用NIF／LPS注射组的肺泡灌洗液内中性粒细胞数与LPS组比较却明显降低(P＜0.05)。在NIF注射组中单核细胞明显增多。NIF转基因后，对LPS诱发的急性肺损伤中白细胞浸润及肺内聚集现象有明

2、显的抑制作用。NIF注射后对白细胞总数无明显影响，可使单核细胞数量增加，这可能是机体免疫反应的结果。白细胞抑制因子(抗粘附糖蛋白NIF)是一种41kD糖蛋白。近年来的研究表明NIF能选择性的与白细胞表面的CD11／CD18(白细胞粘附分子)的α键结合，从而抑制中性粒细胞与血管内皮细胞的粘附作用〔1〕。这样，在LPS诱发的急性肺损伤过程中，防止了大量白细胞在肺组织的聚集，减轻炎性反应，也有益于炎症的消退。并可能通过NIF激活体内免疫系统，使单核细胞的数量增多以及吞噬作用增强，达到对肺的保护作用。我们采用阳离子脂类将重组的NIF基因转移给CD-1小鼠。试图探讨NI

3、F在鼠肺内表达后对脂多糖(LPS)诱发的鼠急性肺损伤时白细胞聚集的影响以及循环血中和肺泡灌洗液中白细胞数量的变化。现将结果报告如下:材料与方法一、材料1.实验动物为6～12周雄性健康CD-1小鼠，体重25～30g，所有用于实验的小鼠均在无菌条件下饲养。2.试剂PCR3(克隆媒介)，购自Inritrogen,SanDiegoCA.PBluseript-NIF由DrsMathenMoyle和HonordSouleClorvasInternationalColaJolla,CA等提供；Dimothyldioctudecylammoniumbromide(DDAB)购

4、自Sigma,stLouisMo;胆固醇购自Calbiochem,Co,LaJolla,CA;LPS注射液(0111：B4)购自Sigma,stLouisMo。3.仪器旋转式蒸气仪，购自Brikmann,egaropark,IL。二、方法1.动物分组随机将小鼠分为4组。①正常对照组；②LPS注射组；③NIF注射组；④NIF／LPS注射组。每组16只，注射试剂前及转基因前用含有ketomine(氯胺酮)60mg／kg和xylazine(甲苯噻嗪)20mg／kg的PBS溶液肌肉注射麻醉。试验后的小鼠要求存活48h。2.NIF基因重组将PBluescript,SKt

5、的NIFcDNA克隆剂，PCR-3和ECoRl配置，以完成PCR3-NIF基因重组。应用PCR3-Bgal和PCR3-NIF转移给293细胞(人胚肾细胞)的方法，在体外已证实了转基因的表达。3.重组NIF在小鼠体内基因转移将含有DDAB和胆固醇(1∶1比例)的混合物，用旋转式蒸气仪混合干燥，再以5%葡萄糖液溶解，充分混合约20min，以DNA(NIF)1mg对8nmoles的胆固醇比例构成转基因混合物，通过球后静脉将重组基因复合物注射给小鼠(500mg／只)。4.鼠肺转基因表达的证实应用SuperScriptPreamplification试剂系统，完成PT-

6、PCR过程，用无RNase的DNaseⅠ对肺组织的RNA样品作预处理，消除污染，用oligo-dT引物和反转录酶混合标本，42°C下孵育1h，合成cDNA，再加入0.5nM引物(5＇ACACAACCTGAGGT-GC和3＇-AG-CAGAGTCCGTGATC)进行多聚酶链反应(PCR)，PCR在94°C30s，55°C1min，72°C45s条件下进行。然后对每组肺组织的RNA(10μg／每个样品)样品，通过在甲酰胺和甲醛溶液中55°C，15min变性处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳。通过Northern杂交，RNA被印迹在Duralose-uv膜上；按试剂应用说

7、明进行冲洗，再用(a-P32)dCTP(3000Ci／mmole)标化cDNA探针，最后在-80°C下进行放射自显影6h。5.急性肺损伤模型的制备将LPS溶液200mg(以PBS0.5ml溶解，PH7.4)，分别经腹腔注射给小鼠。注射后2h处死小鼠，经右心室采血。进行白细胞总分数测定。然后气管插管，应用3mlPBS溶液反复支气管肺泡灌洗3次，再将灌洗液离心。用cytosprin染色后进行分类计数。按照常规方法，每张片子计数300个细胞，分别统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，取均值进行计算。6.对照组及实验组动物处理为测定LPS引起肺损伤时NIF对白细胞的影响

8、，在LPS注射前每组的16只小鼠分别经