白细胞抑制因子对鼠急性肺损伤时白细胞的影响论文

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1、白细胞抑制因子对鼠急性肺损伤时白细胞的影响论文摘要:为探讨白细胞抑制因子(NIF)转基因后在鼠急性肺损伤时肺内、循环静脉血中白细胞的影响。本实验采用阳离子脂类，NIF基因重组法，用脂多糖(LPS)致鼠急性肺损伤，分组测定静脉血及肺泡内白细胞的变化。结果发现LPS诱发急性肺损伤后2h静脉血中白细胞明显减少(P＜0.01)，在肺泡灌洗液内中性粒细胞明显增多(P＜0.01)。而采用NIF／LPS注射组的肺泡灌洗液内中性粒细胞数与LPS组比较却明显降低(P＜0.05)。在NIF注射组中单核细胞明显增多。NIF转基因后，对LPS诱发的急性肺

2、损伤中白细胞浸润及肺内聚集现象有明显的抑制作用。NIF注射后对白细胞总数无明显影响，可使单核细胞数量增加，这可能是机体免疫反应的结果。白细胞抑制因子(抗粘附糖蛋白NIF)是一种41kD糖蛋白。近年来的研究表明NIF能选择性的与白细胞表面的CD11／CD18(白细胞粘附分子)的α键结合.freelothyldioctudecylammoniumbromide(DDAB)购自Sigma,stLouisMo;胆固醇购自Calbiochem,Co,LaJolla,CA;LPS注射液(0111：B4)购自Sigma,stLouisMo。3.

3、仪器旋转式蒸气仪，购自Brikmann,egaropark,IL。二、方法1.动物分组随机将小鼠分为4组。①正常对照组；②LPS注射组；③NIF注射组；④NIF／LPS注射组。每组16只，注射试剂前及转基因前用含有ketomine(氯胺酮)60mg／kg和xylazine(甲苯噻嗪)20mg／kg的PBS溶液肌肉注射麻醉。试验后的小鼠要求存活48h。2.NIF基因重组将PBluescript,.freelin，以DNA(NIF)1mg对8nmoles的胆固醇比例构成转基因混合物，通过球后静脉将重组基因复合物注射给小鼠(500mg／

4、只)。4.鼠肺转基因表达的证实应用SuperScriptPreamplification试剂系统，完成PT-PCR过程，用无RNase的DNaseⅠ对肺组织的RNA样品作预处理，消除污染，用oligo-dT引物和反转录酶混合标本，42°C下孵育1h，合成cDNA，再加入0.5nM引物(5′ACACAACCTGAGGT-GC和3′-AG-CAGAGTCCGTGATC)进行多聚酶链反应(PCR)，PCR在94°C30s，55°C1min，72°C45s条件下进行。然后对每组肺组织的RNA(10μg／每个样品)样品，通过在甲酰胺和甲醛溶

5、液中55°C，15min变性处理，然后进行琼脂糖凝胶电泳。通过Northern杂交，RNA被印迹在Duralose-uv膜上；按试剂应用说明进行冲洗，再用(a-P32)dCTP(3000Ci／mmole)标化cDNA探针，最后在-80°C下进行放射自显影6h。5.急性肺损伤模型的制备将LPS溶液200mg(以PBS0.5ml溶解，PH7.4)，分别经腹腔注射给小鼠。注射后2h处死小鼠，经右心室采血。进行白细胞总分数测定。然后气管插管，应用3mlPBS溶液反复支气管肺泡灌洗3次，再将灌洗液离心。用cytosprin染色后进行分类计数

6、。按照常规方法，每张片子计数300个细胞，分别统计中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞，取均值进行计算。6.对照组及实验组动物处理为测定LPS引起肺损伤时NIF对白细胞的影响，在LPS注射前每组的16只小鼠分别经球后静脉注射PBS、NIF及NIF／脂复合物(500mg)各0.1ml，经48h后再经腹腔内注入LPS200mg。注射后2h,分别处死动物，进行有关项目的测定。三、统计分析所有数据资料以±s表示，组间比较采用t检验。结果1.LPS腹腔内注入引起鼠的急性肺损伤经正常小鼠以200mg的LPS腹腔注射，2h后发现鼠的肺泡内有明显的白细

7、胞浸润，而采用NIF／脂复合物注射组，虽然用等剂量的LPS注射，但未见肺内有明显的白细胞聚集现象。2.采用KT-PCR方法及Northern杂交，证明了NIF基因在小鼠肺内有较高水平表达，并证明DNA片段含有720个BP。在对照样品中用DNaseⅠ预处理而没有反转录的样品中，没有观察到这种PCR产物。3.各组动物血液及肺泡灌洗液中白细胞的变化见表1和表2。表1血液中(静脉血)白细胞的变化(±s)组别白细胞总数(G／L)中性粒细胞(%)单核细胞(%)淋巴细胞(%)正常对照组6.5±0.629.4±2.23.8±0.565.7±6.0

8、LPS注射组2.3±0.5**45.7±7.4*3.2±0.551.8±7.6NIF注射组5.6±0.720.92±5.320.8±7.353.0±6.2NIF／脂复合物注射组5.0±0.718.4±6.3△28.7±9.7△△52.2±6.2注：