oxldl和生理浓度抗坏血酸对人脐静脉内皮细胞enos活性的影响

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1、oxLDL和生理浓度抗坏血酸对人脐静脉内皮细胞eNOS活性的影响：张泉三董果雄张社华【摘要】目的探讨氧化低密度脂蛋白（oxLDL）和生理浓度抗坏血酸对乙酰胆碱诱导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性及一氧化氮（NO）生成量的影响及其可能机制。方法在培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中加入25、50、100mg/L的oxLDL和生理浓度抗坏血酸作用24h后，测定NO生成量、eNOS活性及细胞内谷胱甘肽（GSH）含量。结果oxLDL以剂量依赖方式降低乙酰胆碱诱发的eNOS活性，减少NO的生成；生理浓度抗坏血酸改善eNOS活性，同时增加NO生成，差异均有显著性（F=50.0

2、75、48.400，q=3.773～19.998，P<0.05、0.01）。而细胞内GSH的含量在oxLDL（50mg/L）组与抗坏血酸组无明显差异。结论oxLDL通过降低eNOS活性而减少NO的生成。生理浓度抗坏血酸通过直接影响eNOS活性而抑制该效应，此与其抗氧化作用无关。【关键词】脂蛋白类LDL抗坏血酸内皮细胞一氧化氮一氧化氮合酶［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheeffectsanditsmechanismofoxidizedloanumbilicalveinendothelialcells.MethodsTheendoth

3、elialcellsol/L)andsubsequentlyexposedtodifferentconcentrationsofoxLDLfrom0to100mg/Lfor24hat37℃.NOproduction,eNOSactivity,andlevelofglutathioneeasured.ResultsoxLDLdecreasedeNOSactivityandNOproductioninadosedependentmanner.LascorbicacidatphysiologicalconcentrationenhancedeNOSactivityandNO

4、production,g/L)groupandLascorbicacidgroup.ConclusionoxLDLmaydecreaseNOproductionviaattenuatingNOSactivityinHUVECs.LascorbicacidatphysiologicalconcentrationameliorateseNOSactivityol/L的PBS中透析，去除离心制备过程中所加的抗氧化剂；然后用PBS溶液将LDL稀释至蛋白质量浓度为0.5g/L；加入到新鲜配制的含10μmol/L硫酸铜的PBS中37℃氧化12h，然后在4℃含100mg/LEDTA的

5、PBS中透析24h，以终止氧化修饰反应。将制备好的oxLDL以0.22μm滤膜过滤除菌，置4℃保存备用。LDL氧化修饰程度用硫代巴比妥酸反应物质的含量来鉴定。1.3HUVECs株的培养HUVECs株用含体积分数0.15小牛血清的DMEM培养液在37℃培养箱内培养3～5d，待细胞融合后，用0.5g/L胰蛋白酶与0.2g/LEDTA进行消化。显微镜下观察到细胞收缩变圆时弃去消化液,加入培养液以终止胰蛋白酶作用。用滴管吹打壁上的细胞，使其完全脱落并分离。调整细胞浓度至3×108/L,接种于24孔板上培养。待细胞融合后，换用无血清无酚红DMEM培养液,然后即可进行实验。1.4实验分

6、组及处理实验分为5组,每组6份样品。对照组（①组）：只加入1mL的培养液；25、50、100mg/LoxLDL组（②、③、④组）：分别加入相应浓度的oxLDL各1mL；抗坏血酸组（⑤组）：先加入100μmol/L的L抗坏血酸1mL预处理24h，然后再加入50mg/L的oxLDL1mL。以上各组在测试前1h分别加入1μmol/L的乙酰胆碱。1.5测定指标及方法1.5.1NONO-2及NO-3为NO的稳定代谢产物，已被证实为指示NO产生水平的优良指标。分别收集各组细胞培养液，按照NO测试盒说明书操作测定NO-2及NO-3的含量。1.5.2NOS活性NOS催化L精氨酸和分

7、子氧反应生成NO，NO与亲和性物质生成有色化合物，在530nm波长下测吸光度，根据吸光度的大小，计算出NOS活力。操作按试剂盒说明书进行。1.5.3GSH用超声细胞粉碎仪将内皮细胞粉碎、离心，取上清，应用比色法测定GSH的含量。操作按试剂盒说明书进行。1.6统计学分析所有实验数据以±s表示。多组数据比较用方差分析,相关性采用直线回归分析,两组均数比较采用小样本t检验。2结果②、③、④组eNOS活性及NO含量均低于①组，差异有显著性（F=50.075、48.400，q=4.403～19.998，P<