cd59配体肽基因对卵巢癌细胞cd59表达的影响

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1、CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响：李伟伟高美华张蓓解西河【摘要】目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RTPCR及TT法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780CD59mRNA及蛋白的表达水平与ethodsAeukaryoticexpressionrebinantofligandpeptideofCD59RNAandproteinRNAandprotei

2、nintransfectedA2780cellsRNAandproteinonthesurfaceofA2780cells,in;然后94℃变性30s，46℃退火1min，68℃延伸2min，5个循环;最后68℃延伸5min。取上述扩增产物2μL在30g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。CD59配体pIRES真核表达重组体构建及鉴定：spdsDNA片段回收纯化，与Tvector4℃过夜连接，连接产物TSS法转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素及蓝白斑筛选，随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌，小提质粒。质粒分别行PCR、NheⅠ单酶切、DNA测序法鉴定CD59配体pIR

3、ES18T阳性重组子。CD59配体pIRES18T阳性重组子质粒行EcoRⅠ、NheⅠ双酶切，回收纯化外源基因片段。pIRES真核表达质粒的获得与纯化与外源基因片段获得方法相同。外源基因片段与载体的连接、连接产物的转化、阳性重组子质粒PCR及DNA测序鉴定方法同sp18T重组克隆载体。质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切后，取酶切产物5μL在15g/L的琼脂糖凝胶上电泳。　　1.2.3人卵巢癌细胞A2780的转染及稳定转染细胞系的建立参照《分子克隆实验指南(第3版)》中的方法进行转染,G418压力筛选建立稳定转染细胞系。CD59配体pIRES重组质粒转染细胞命名

4、为CD59配体A2780,pIRES空质粒转染细胞命名为10mL(1∶4000)，37℃孵育1h后洗膜;加入化学发光显色剂ECM显色,暗室条件下X线片感光1min，显影。用BandScan分析软件行条带灰度扫描，求其百分比数值后进行统计学分析。　　1.2.7兔抗人A2780细胞抗血清的制备A2780细胞用含体积分数0.10小牛血清的RPMI1640培养液培养至细胞生长状态良好。用2.5g/L的胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗3次，调整细胞密度至2×1011/L，免疫家兔。免疫结束10d后，心脏采血并自然沉淀分离血清(抗体效价为1∶5120)。　　1.2.8MTT法检

5、测细胞增殖抑制率分别收集CD59配体A2780、I1640基础培养液调整细胞密度至2×108/L，置于96孔培养板中，每孔50μL。每标本设6个复孔。每孔加兔抗人A2780细胞抗血清及含体积分数0.08新鲜人血清各10μL,37℃孵育1h，每孔加浓度为5g/L的MTT10μL,37℃孵育4h，弃上清后加入100μLDMSO，轻轻吹打混匀后置摇床上50r/min震荡溶解15min。于波长630nm处测各孔吸光度(A)值并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[1-(实验组A-阴性对照组A)]/(阳性对照组A-阴性对照组A)×100%。重复3次取其平均值。　　2.3RT

6、PCR检测CD59配体肽基因mRNA表达　　CD59配体A2780的PCR产物电泳后可见长约63bp清晰条带(图3)，证实CD59配体肽真核表达重组体成功转染A2780细胞。　　2.4RTPCR检测CD59mRNA的表达CD59配体A2780及AC中的C8和(或)C9结合从而抑制补体的活化。许多研究显示，肿瘤细胞中CD59的表达主要有以下特点。肿瘤细胞可以诱导血管内皮生长因子的分泌,从而诱导肿瘤细胞表面上调CD59的表达,增加周围基质中CD59的沉积。在某些肿瘤中一些急性炎症因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6在肝癌中能上调CD59的表达[7

7、]。表达CD59的肿瘤细胞自身可以向周围基质释放一些含有锚结构可溶性的CD59，可以插入到同源细胞的胞膜上，具有补体限制作用，在肿瘤微环境中可以阻止补体及抗体等对肿瘤细胞的结合[8]。　　对肿瘤免疫的研究发现,CRP在肿瘤逃避免疫攻击中起了非常重要的作用，CD59在多种泌尿系统常见恶性肿瘤及女性生殖系统恶性肿瘤均有高表达，提示与肿瘤逃逸相关。MURRAY等[1]用免疫组织化学等方法对54例良恶性子宫内膜组织中CRP的表达进行检测，发现恶性子宫内膜组织高表达CD59，并推测这是恶性子宫内膜组织之所以能逃避补体攻击所致细胞溶解的原因，并由此间接促进其致癌作用。　　卵