cd59sirna对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作

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1、CD59siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作【摘要】目的探讨针对CD59的siRNA(CD59siRNA)对人卵巢癌裸鼠移植瘤CD59的沉默效应及其抑瘤作用。方法采用脂质体转染法将CD59干扰质粒(T组)和空质粒(V组)转染A2780细胞，获得稳定表达细胞株，将T组、V组A2780细胞和未转染(C组)的A2780细胞分别接种于裸鼠皮下建立肿瘤模型，通过绘制肿瘤生长曲线、RTPCR和免疫组织化学法研究其抑瘤效应和对CD59基因及蛋白的沉默效应。结果与V组和C组比较，T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01～30.41,P<0.05)，CD59基因及

2、蛋白表达减少(F=817.77、247.71,q=26.59～52.25,P<0.05)。结论特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体可以明显抑制CD59的表达及卵巢癌在体内的生长。【关键词】抗原,CD59;卵巢肿瘤;RNA干扰;小鼠，裸[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatetheinhibitioneffectofCD59siRNAonCD59geneandthegroice.MethodsA2780cellsid(groupT)andblankplasmid(groupV),respectively,usingLipofectamne2000.Th

3、esecellsandA2780cellsice.TheinhibitioneffectofCD59siRNAontumorandtheexpreesionofCD59orgromunohistochemistry(IHC).ResultsparedorvolumeandRNAandCD59alsodecreased(F=817.77,247.71;q=26.59-52.25;P<0.05).ConclusionCD59siRNAcansignificantlysuppresstheexpressionofCD59andgros;RNAinterference;mice,nud

4、e　　CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能,其最重要的功能是作为补体系统终末阶段的调节蛋白，以同源限制的方式抑制补体攻膜复合物(MAC)的装配以保护宿主细胞免受补体溶解破坏[13]。近年来，国内外文献报道，多种实体肿瘤细胞膜表面高表达CD59等一系列膜补体调节蛋白(mCRPs)，使肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视[4]，与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[5]，同时也是导致众多肿瘤治疗失败的重要原因。本课题组前期利用RNA干扰技术(RNAi)构建了针对CD59的pSUPERCD59siRNA重组载体[67]，并在体外实验证

5、明了其对CD59的沉默效应。为深入了解CD59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响，本研究利用该重组载体，观察其在荷瘤裸鼠体内对肿瘤细胞CD59基因的沉默及抑瘤效应，为肿瘤基因治疗提供动物实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　人卵巢癌细胞系A2780细胞由本实验室保存;小鼠抗人CD59抗体购自BDPharmingen公司;Lipofectamne2000和总RNA提取试剂盒均购自Invitrogen公司;4～6周龄雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pSUPER质粒由我院罗兵教授惠赠;重组质粒pSUPERCD59siRNA由本室构建和保存;AccessRTPCRA

6、1250试剂盒购自Promega公司;DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司;SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选用　2.5g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞，调整细胞密度达2×108/L,取0.5mL加入24孔细胞培养板过夜培养，待细胞达到80%～90%汇合时进行转染。利用脂质体Lipofectamne2000，将pSUPERCD59siRNA及空质粒pSUPER分别转染A2780细胞。G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞的细胞克隆,扩大培养。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为干扰组(T组)

7、，空质粒整合的细胞克隆为阴性对照组(V组)，未转染的A2780细胞为空白对照组(C组)。　　1.2.2移植瘤裸鼠模型的建立4～6周龄雌性裸鼠饲养在SPF环境中,随机分为3组(T组、V组和C组)，每组6只。采用常规培养细胞种植法，收集处于对数生长期的各组A2780细胞，于相应组每只裸鼠右腋皮下注射细胞5×106个(0.2mL)。连续观察30d，记录肿瘤出现的时间;并于接种后每5d测量肿瘤的长轴(L)和短轴(RNA的表达Trizol试剂