cd59配体肽基因对卵巢癌细胞cd59表达的影响论文

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1、CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响论文李伟伟高美华张蓓解西河【摘要】目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RTPCR及TT法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780CD59mRNA及蛋白的表达水平与ethodsAeukaryoticexpressionrebinantofligandpeptideofCD59RNAandproteinRNAandprotein

2、intransfectedA2780cellsRNAandproteinonthesurfaceofA2780cells,.freelin;然后94℃变性30s，46℃退火1min，68℃延伸2min，5个循环;最后68℃延伸5min。取上述扩增产物2μL在30g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳。CD59配体pIRES真核表达重组体构建及鉴定：spdsDNA片段回收纯化，与Tvector4℃过夜连接，连接产物TSS法转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素及蓝白斑筛选，随机选取单克隆白斑菌落过夜摇菌，小提质粒。质粒分别行PCR、NheⅠ单酶切、DNA测序法鉴定CD59配体

3、pIRES18T阳性重组子。CD59配体pIRES18T阳性重组子质粒行EcoRⅠ、NheⅠ双酶切，回收纯化外源基因片段。pIRES真核表达质粒的获得与纯化与外源基因片段获得方法相同。外源基因片段与载体的连接、连接产物的转化、阳性重组子质粒PCR及DNA测序鉴定方法同sp18T重组克隆载体。质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切后，取酶切产物5μL在15g/L的琼脂糖凝胶上电泳。1.2.3人卵巢癌细胞A2780的转染及稳定转染细胞系的建立参照《分子克隆实验指南(第3版)》中的方法进行转染,G418压力筛选建立稳定转染细胞系。CD59配体pIRES重组质粒转染细胞命名为

4、CD59配体A2780,pIRES空质粒转染细胞命名为10mL(1∶4000)，37℃孵育1h后洗膜;加入化学发光显色剂ECM显色,暗室条件下X线片感光1min，显影。用BandScan分析软件行条带灰度扫描，求其百分比数值后进行统计学分析。1.2.7兔抗人A2780细胞抗血清的制备A2780细胞用含体积分数0.10小牛血清的RPMI1640培养液培养至细胞生长状态良好。用2.5g/L的胰酶消化成单细胞悬液，PBS洗3次，调整细胞密度至2×1011/L，免疫家兔。免疫结束10d后，心脏采血并自然沉淀分离血清(抗体效价为1∶5120)。1.2.8MTT法检测细胞增殖抑制

5、率分别收集CD59配体A2780、I1640基础培养液调整细胞密度至2×108/L，置于96孔培养板中，每孔50μL。每标本设6个复孔。每孔加兔抗人A2780细胞抗血清及含体积分数0.08新鲜人血清各10μL,37℃孵育1h，每孔加浓度为5g/L的MTT10μL,37℃孵育4h，弃上清后加入100μLDMSO，轻轻吹打混匀后置摇床上50r/min震荡溶解15min。于波长630nm处测各孔吸光度(A)值并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-(实验组A-阴性对照组A)/(阳性对照组A-阴性对照组A)×100%。重复3次取其平均值。1.2.9统计学处理利用SSPS15

6、.0及PPMS1.55统计软件包进行统计学分析。2结果2.1CD59配体pIRES真核表达重组体PCR及酶切鉴定CD59配体pIRES真核表达重组体进行质粒PCR，电泳后可见长63bp清晰条带(图1)，CD59配体pIRES真核表达重组体行质粒EcoRⅠ、NheⅠ双酶切，电泳可见长78bp清晰条带(图2)，证实CD59配体pIRES真核表达重组体构建成功2.3RTPCR检测CD59配体肽基因mRNA表达CD59配体A2780的PCR产物电泳后可见长约63bp清晰条带(图3)，证实CD59配体肽真核表达重组体成功转染A2780细胞。2.4RTPCR检测CD5

7、9mRNA的表达CD59配体A2780及AC中的C8和(或)C9结合从而抑制补体的活化。许多研究显示，肿瘤细胞中CD59的表达主要有以下特点。肿瘤细胞可以诱导血管内皮生长因子的分泌,从而诱导肿瘤细胞表面上调CD59的表达,增加周围基质中CD59的沉积。在某些肿瘤中一些急性炎症因子，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6在肝癌中能上调CD59的表达7。表达CD59的肿瘤细胞自身可以向周围基质释放一些含有锚结构可溶性的CD59，可以插入到同源细胞的胞膜上，具有补体限制作用，在肿瘤微环境中可以阻止补体及抗体等对肿瘤细胞的结合8。对肿瘤