cd59sirna对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用

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1、CD59siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用【关键词】抗原,CD59;卵巢肿瘤;RNA干扰;小鼠，裸[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatetheinhibitioneffectofCD59siRNAonCD59geneandthegroice.MethodsA2780cellsid(groupT)andblankplasmid(groupV),respectively,usingLipofectamne2000.ThesecellsandA2780cellsice.TheinhibitioneffectofCD59siRNAontum

2、orandtheexpreesionofCD59orgromunohistochemistry(IHC).ResultsparedorvolumeandRNAandCD59alsodecreased(F=817.77,247.71;q=26.59-52.25;P<0.05).ConclusionCD59siRNAcansignificantlysuppresstheexpressionofCD59andgros;RNAinterference;mice,nude　　CD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能,

3、其最重要的功能是作为补体系统终末阶段的调节蛋白，以同源限制的方式抑制补体攻膜复合物(MAC)的装配以保护宿主细胞免受补体溶解破坏[13]。近年来，国内外文献报道，多种实体肿瘤细胞膜表面高表达CD59等一系列膜补体调节蛋白(mCRPs)，使肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视[4]，与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[5]，同时也是导致众多肿瘤治疗失败的重要原因。本课题组前期利用RNA干扰技术(RNAi)构建了针对CD59的pSUPERCD59siRNA重组载体[67]，并在体外实验证明了其对CD59的沉默效应。为深入了解CD59基因表达变化对肿瘤细胞在体内生长的影响，

4、本研究利用该重组载体，观察其在荷瘤裸鼠体内对肿瘤细胞CD59基因的沉默及抑瘤效应，为肿瘤基因治疗提供动物实验依据。　　1材料和方法　　1.1材料　　人卵巢癌细胞系A2780细胞由本实验室保存;小鼠抗人CD59抗体购自BDPharmingen公司;Lipofectamne2000和总RNA提取试剂盒均购自Invitrogen公司;4～6周龄雌性裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司;pSUPER质粒由我院罗兵教授惠赠;重组质粒pSUPERCD59siRNA由本室构建和保存;AccessRTPCRA1250试剂盒购自Promega公司;DAB显色试剂盒购自北京中杉金

5、桥公司;SABC免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞转染及稳定转染细胞克隆的筛选用　2.5g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞，调整细胞密度达2×108/L,取0.5mL加入24孔细胞培养板过夜培养，待细胞达到80%～90%汇合时进行转染。利用脂质体Lipofectamne2000，将pSUPERCD59siRNA及空质粒pSUPER分别转染A2780细胞。G418选择性培养基中筛选具有抗性的单细胞的细胞克隆,扩大培养。将筛选出的干扰质粒整合的细胞克隆作为干扰组(T组)，空质粒整合的细胞克隆为阴性对照组(V组)，未转染

6、的A2780细胞为空白对照组(C组)。　　1.2.2移植瘤裸鼠模型的建立4～6周龄雌性裸鼠饲养在SPF环境中,随机分为3组(T组、V组和C组)，每组6只。采用常规培养细胞种植法，收集处于对数生长期的各组A2780细胞，于相应组每只裸鼠右腋皮下注射细胞5×106个(0.2mL)。连续观察30d，记录肿瘤出现的时间;并于接种后每5d测量肿瘤的长轴(L)和短轴(S1.5[9]统计学软件进行数据处理，结果以±s表示，组间比较采用方差分析。　　2结果　　2.1裸鼠移植瘤生长曲线　　皮下注射卵巢癌A2780细胞6～8d后，V组和C组的裸鼠均可观察到4～6mm大小皮下肿瘤结节，并随时

7、间的延长不断增大;而T组在接种后12～15d才可观察到肿瘤结节，并且生长缓慢。18只裸鼠无死亡，所有肿瘤包块均无红肿和溃破。裸鼠肿瘤生长曲线(图1)显示，与V组和C组相比，T组肿瘤的生长明显受到抑制。接种后第30天,与V组和C组比较，T组肿瘤体积和质量明显减小(F=301.88、5.39,q=4.01～30.41,P<0.05);V组与C组的肿瘤体积和质量比较，差异无显著意义(q=0.75、0.02,P>0.05),见表1。表1各组裸鼠移植瘤的质量和体积　　2.2各组裸鼠移植瘤CD59mRNA表达比较　　各组裸鼠肿瘤组织中CD