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时间:2018-12-01
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1、Endostatin抑制人卵巢癌细胞生长及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用刘梅梅,隋丽华,李佩玲,程丽【关键词】抑制 【关键词】卵巢癌;移植瘤;内皮抑素;Bcl2/Bax 0引言 我们采用人浆液性乳头状囊腺癌SKOV3细胞系及其荷瘤鼠为研究对象,研究Endostatin对其增殖、凋亡的影响及作用机制,为其应用于卵巢癌的临床治疗提供试验依据. 1材料和方法 1.1材料 选用雌性6~8周龄BALB/c裸鼠10只,SPF条件下饲养.人浆液性乳头状囊腺癌细胞系SKOV3由北京医科大学人民医院妇产科馈赠,用RPMI1
2、640(含10g/L小牛血清)培养基于37℃,50mL/LCO2条件下培养.Endostatin购自烟台麦得津生物工程公司,置于4℃保存.抗Bcl2,抗BaxmAb及SP试剂盒购自北京中衫试剂公司. 1.2方法 1.2.1MTT法测定SKOV3细胞生长抑制率分组:PBS对照组(10mmol/LPBS)和实验组(0.1,1.0,5.0,10.0和15.0mg/LEndostatin).SKOV3细胞以5×107/L密度接种于96孔板,每组设定6个平行孔,并设定空白对照.细胞贴壁培养24h后,分别加入上述不同浓度
3、的药物,作用48h后测定细胞A490值.计算Endostatin对卵巢癌细胞SKOV3生长的影响和抑制情况.抑制率=(PBS对照组A490-药物组A490)/PBS对照组A490×100%. 1.2.2透射电镜下观察SKOV3细胞凋亡实验组SKOV3细胞作用不同时间(24,48和72h)后,消化离心,用4℃,0.25g/L戊二醛固定,0.1g/L锇酸后固定,系列乙醇丙酮脱水,环氧树脂包埋,制成超薄切片,透射电镜下观察细胞凋亡形态. 1.2.3免疫细胞化学检测凋亡调控相关蛋白质表达的变化实验组SKOV3细胞爬片
4、培养作用不同时间(24,48和72h)后,丙酮室温固定10min,进行免疫细胞化学SP法染色.按说明书操作,DAB显色.结果判定:以细胞核和细胞质呈明确的棕黄色为阳性染色. 1.2.4Endostatin对裸鼠肿瘤生长的影响 1.2.4.1裸鼠皮下瘤模型的建立已培养的SKOV3细胞,使细胞浓度达到5×1010/L,从裸鼠右肩胛部近腋窝处进针,每只裸鼠注射一点,约1×107个细胞.观察接种部位有无渗出、肿瘤生长及裸鼠状况,待皮下瘤体积约100mm×100mm×100mm时分组实验. 1.2.4.2Endost
5、atin对卵巢肿瘤的治疗作用将裸鼠随机分成治疗组和对照组,每组5只.实验组裸鼠每日皮下注射Endostatin20mg/kg,注射部位远离肿瘤形成部位,对照组以同样方法每日注射PBS.每日测量肿瘤长度和宽度,计算肿瘤体积.治疗21d后将裸鼠处死,剥离出皮下肿瘤,备用. 1.2.5Endostatin对肿瘤组织中细胞凋亡的影响将切下的瘤组织置于0.25g/L戊二醛中,4℃固定,电镜观察瘤组织中细胞形态的改变和观察细胞是否出现凋亡小体. 1.2.6Endostatin对瘤组织中Bcl2及Bax蛋白和mRNA表达的
6、影响常规免疫组织化学法检测瘤组织中Bcl2及Bax蛋白的表达情况.将切下的瘤组织置于液氮中,采用常规RTPCR方法观察Endostatin对Bcl2及BaxmRNA表达的影响.引物由上海生物工程有限公司合成,序列引自文献〔1〕. 统计学处理:数据均以x±s表示,采用Studentst检验. 2结果 2.1Endostatin对SKOV3细胞生长的抑制作用不同浓度的Endostatin处理SKOV3细胞48h后,与对照组相比,SKOV3的生长均受到不同程度的抑制.比较A490值结果显示,细胞PBS对照组、0.
7、1,1.0和5.0mg/LEndostatin组之间差异无统计学意义(P>0.05),而10.0和15.0mg/LEndostatin组的A490值分别与前4组比较,其差异有统计学意义(P0.01). 2.2Endostatin对SKOV3细胞凋亡的影响在透射电镜下观察,Endostatin处理SKOV3后,可见细胞皱缩,胞核固缩,细胞质内可见线粒体嵴絮状变,出现凋亡细胞,随Endostatin作用时间延长和剂量的增加,上述变化越来越明显(图1). 2.3Endostatin对SKOV3细胞凋亡调控相关
8、蛋白表达的影响SKOV3细胞中Bcl2和Bax蛋白表达均定位于胞质和胞核.与对照组相比,Endostatin处理后的SKOV3细胞中,Bcl2和Bax蛋白表达未见明显增强和减弱,并且在Endostatin作用时间和剂量上亦无明显相关性. 2.4Endostatin对裸鼠皮下移植SKOV3肿瘤生长的影响Endostatin治疗组肿瘤生长缓慢,治疗15d后,肿瘤体积明显小于
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