利用sirna抑制环氧合酶2对人胃癌裸鼠移植瘤的影响

《利用sirna抑制环氧合酶2对人胃癌裸鼠移植瘤的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、利用siRNA抑制环氧合酶2对人胃癌裸鼠移植瘤的影响作者：黄国民林瑞新房学东刘斌【摘要】目的观察环氧合酶2（COX2）对人胃癌裸鼠移植瘤的影响并探讨其机制。方法构建靶向COX2表达质粒和在BALB/c裸鼠皮下建立SGC7901人胃癌细胞动物模型，用COX2表达质粒基因转染治疗。结果构建的COX2表达质粒在体内、外均可稳定表达。COX2基因治疗可抑制裸鼠皮下肿瘤的生长和淋巴管的生成。COX2基因转染下调血管内皮生长因子C（VEGFC）的表达。结论通过构建靶向COX2siRNA真核表达载体可抑

2、制人胃癌裸鼠移植瘤的生长和淋巴管生成，COX2对抑制胃癌细胞（SGC7901）治疗有确切效果。【关键词】胃肿瘤;环氧合酶2;基因治疗目前对于胃癌的治疗效果仍不理想，作为中晚胃癌主要治疗手段的化疗和放疗，在杀灭肿瘤细胞的同时，也损伤正常的组织细胞，疗效低、毒副作用大。有研究表明环氧合酶2（COX2）在多种肿瘤中呈高表达，并可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要的作用〔1，2〕。但由于COX2抑制剂尚存在特异性和抑制效率等方面的不足，因此需要研究如何提高COX2治疗的敏感性。本研究希望通过构建表达靶向C

3、OX2的短发夹状双链RNA（shRNA）的表达质粒，转染人胃癌细胞系SGC7901，探讨其抑制肿瘤细胞生长的机制及对淋巴管生成的影响。　　1材料与方法　　1.1动物及试剂　　BALB/c裸鼠，4RNA表达　　根据GenBank公布的COX2cDNA序列，利用primer5软件设计引物。以βactin为内参照。由上海博亚生物技术有限公司合成。COX2引物:上游:5′TCAAGTCCCTGAGCATCIAC3′，下游:5′CATTCCTACCACCAGCAACC3′。目的片段长度488bp。βa

4、ctin引物:上游:5′GAAACTACCTTCAACTCCATC3′，下游:5′CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC3′，目的片段长度219bP。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳嗅化乙锭染色，紫外灯下检查，计算机扫描电泳图像，测出各条带的灰度值。　　1.4动物模型及分组　　实验动物分为3组，每组5只，分别为:接种pGenesil1COX2siRNA质粒组、接种pGenesil1cotrolsiRNA质粒对照组、接种SGC7901组。计数为1×107的细胞接种于裸鼠右前肢腋下，3组细

5、胞接种裸鼠后第4天可见肿瘤长出，每隔4d测量1次裸鼠最长径a值和最短径b值，4RNA水平　　采用Invitrogen公司的Trizol试剂提取肿瘤组织的总RNA,Toyobo公司的RTPCR一步法试剂盒。COX2引物，上游：5′GTCAAAACCGAGGTGTATGT3′；下游：5′AAGTTGGTGGACTGTCAATC3′；扩增产物长度为270bp。扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳30min，EB染色，用BIORAD分析仪上观察并记录结果。　　1.7统计学处理　　所有实验数据取x±s，采用单向方差分

6、析(0ne3，干扰组与SGC7901组、阴性对照组之间有显著性差异(P＜0.05)；SGC7901组与阴性对照组之间无显著性差异(P＞0.05)，干扰组肿瘤体积抑制率为55%，干扰组对肿瘤生长明显抑制(P＜0.05)。　　2.2基因转染COX2在SGC7901成瘤组织中的表达　　COX2蛋白主要为细胞浆表达，阳性染色主要为细胞浆呈棕褐色。SGC7901组镜下约70%～80%的面积为阳性染色。阴性对照组也表现为强阳性，而干扰组COX2蛋白为弱阳性表达。　　2.3基因转染COX2抑制VEGFC基

7、因表达减少，SGC7901成瘤组织中淋巴管的减少　　光镜下可见肿瘤组织中的MLV呈棕色，为单个或成簇的细胞，可有或无管腔。MLV大多集中在肿瘤边缘，肿瘤中心MLVD较肿瘤边缘相对减少。干扰组MLVD为8.42±3.3，对照组为18.34±7.1，SGC7901组为19.1±6.0，转染了干扰载体的肿瘤和未转染组之间有显著性差异（P<0.05）。　　2.4半定量RTPCR检测COX2mRNA表达　　以琼脂糖电泳条带的亮度判断COX2mRNA表达高低。实验结果显示，与生理盐水处理组COX2mRNA

8、表达相比，pGenesil1cotrolsiRNA处理组COX2mRNA几乎无改变，而pGenesil1COX2siRNA质粒处理组COX2mRNA表达明显下调，经软件分析,mRNA下调72.15%。　　3讨论淋巴转移是胃癌最主要的转移途径，早期胃癌即可出现淋巴转移，进展期胃癌淋巴转移高达70%以上，是影响手术效果及预后的一个主要因素。由于缺乏明确的淋巴管生成因子和标