cd59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响

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1、CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响【摘要】目的观察CD59结合短肽(sp22)对补体介导高表达人CD59分子的PC3细胞溶解的影响。方法利用脂质体法将携带人野生型CD59基因的pIRES质粒(oleculesonlysisofplementmediatedprostatecancerPC3cellsanmunohistochemistrytechnique.Theeffectofsp22orantiCD59monoclonalantibodyonplementmediatedcytotoxicitytotransfectedPC3cel

2、lsentlysisassays.ResultsPC3cellshighlyexpressingCD59moleculeseconcentrationofsp22andantiCD59monoclonalantibody,thelysisrateoftransfectedPC3cellsinsp22grouponoclonalantibodygroup(q=7.805-12.280,P<0.05).Conclusionsp22caneffectivelyblocktheplementbindingsitesofCD59moleculeshighly

3、expressedonPC3cells,therefore,theantitumoreffectoftheplementstimulatedbyantiPC3cellantibodycanbeenhanced.　　[KEYHPMC，委托北京ScilightBiotechnology有限责任公司合成;抗CD59单克隆抗体(H19克隆，BDBiosciences公司产品);FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥公司产品);兔抗PC3细胞多克隆抗体(本教研室按常规方法制备);pIRES真核表达质粒(Takara公司产品);a公司产品);人前列腺癌PC

4、3细胞(我院病理生理学教研室于晓玲教授惠赠)。　　1.2PC3细胞的转染和稳定转染细胞克隆的筛选　　1.2.1PC3细胞的培养PC3细胞用含体积分数0.10胎牛血清、105U/L青霉素、105U/L链霉素的RPMI1640培养液(完全培养液)在37℃、体积分数0.05的CO2条件下培养，达到80%～90%细胞融合度时，用2.5g/L胰酶消化后传代培养。　　1.2.2PC3细胞的转染用2.5g/L胰酶消化生长状态良好的PC3细胞，用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为2×108/L，加入24孔细胞培养板，每孔0.5mL，于37℃、体积分数0.05的C

5、O2条件下培养24h。弃孔内培养液，用RPMI1640培养液洗2次，然后各加0.4mLRPMI1640培养液。按LipofectinReagent试剂说明书中的方法分别将g/L的G418、含体积分数0.10的胎牛血清及105U/L青链霉素RPMI1640培养液在37℃、体积分数0.05的CO2条件下培养筛选转染细胞，隔天换液1次。当单个细胞克隆增殖至数十个细胞时，套取至24孔板中，将G418调整为400mg/L，继续大量扩增培养。　　1.3转染细胞的荧光免疫染色　　分别取ol/LPBS洗涤2次，涂片，吹干。用体积分数0.95的乙醇溶液固定5min，待干。加入1∶

6、1280稀释的抗人CD59单克隆抗体10μL(阴性对照加10μL小鼠IgG2a)，置湿盒中37℃孵育45min;用PBS洗涤3次，每次5min;加入1∶640稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体10μL，湿盒中37℃继续孵育45min;用PBS洗涤3次，每次5min，干后镜检。　　1.4补体溶解试验　　将60%～80%融合度的g/L，每个浓度各设6个复孔。37℃孵育30min后，每孔加入1∶500稀释的兔抗PC3细胞多克隆抗体和新鲜人血清(终浓度为80mL/L)各25μL，37℃孵育1h。每孔各加10μL浓度为5g/L的MTT后，37℃孵育4h，然后每孔加

7、入100g/LSDS0.02mol/L盐酸混合溶液100μL，轻轻吹打混匀后，再利用微量振荡器振荡溶解15min，用酶标仪测定630nm波长处吸光度值。对照组设6个复孔，不加sp22和抗CD59单克隆抗体(用50μLRPMI1640培养液代替);非溶解组设6个复孔，不加兔抗PC3细胞多克隆抗体、抗CD59单克隆抗体和sp22(加75μL的RPMI1640培养液)，余试验条件相同。计算g/L时wPC3细胞的LR分别为(38.96±1.34)%、(42.11±1.29)%、(49.70±1.82)%、(61.14±1.21)%、(75.07±1.01)%，与对

8、照组的LR(32.47±