sirna介导的rnai降低了cd59对补体溶破的抵抗作用

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1、siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用作者：石学香,高美华*,李先平,张蓓,王秋波【摘要】　　目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RTPCR和Westernblot检测转染细胞中CD59基因的表达

2、抑制效果,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确;重组载体转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆,RTPCR和Westernblot表明,稳定转染后CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放试验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:特异性沉默CD59基因的siRNA表达载体以及稳定抑制的细胞系构建和筛选成功,CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗

3、作用降低,为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础。【关键词】shRNA;CD59;A2780;补体14　　［Abstract］AIM:ToconstructrecombinantvectorsexpressingsiRNAthattargetCD59geneandastableinhibitcelllineA2780inordertoanalyzetheroleofCD59intheprotectiontocomplementmediatedcytolysis.METHODS:The60bpenco

4、dedtargetingCD59geneshRNAsequencewasclonedintopSUPERvectorwithDNArecombinanttechnique.TheovarycancercellA2780wastransfectedwiththisrecombinantplasmidusingliposomeandthestablestrainswasselectedbyusingG418medium,CD59mRNAandproteinlevelwasdetectedbyRTPC

5、RandWesternblot,anditsfunctionwasanalysedbydyereleaseassay.RESULTS:ThepSUPERsiRNAexpressingvectorwassuccessfullyconstructed.AndastablecelllineA2780wasselectedandwasdetectedtheexpressionofGFP.ThesiRNAvectoreffectivelyinhibitedtheCD59geneexpressionfromm

6、RNAandproteinlevel.DyereleaseassaysuggestedthatCD59’sprotectiontocomplementmediatedcytolysisdecreased.CONCLUSION:ThesiRNAvectortargetingCD59genecouldconsistentlyinhibitCD59expression.Furthermore,itdecreasedCD59’sprotectionagainstcomplement.Theseresult

7、smaypavethewayforstudyingtheroleofCD59intheimmuneescapeoftumorscellsaswellasintumortherapy．14　　［Keywords］shRNA;CD59;A2780;complement　　［摘要］目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含

8、特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RTPCR和Westernblot检测转染细胞中CD59基因的表达抑制效果,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用的影响。结果:重组载体经PCR及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后送测序,结果表明序列正确;重组载体转染A2780细胞,可表达绿色荧光蛋白,经G418筛选,得到抗性细胞克隆,RTPCR和Westernblot表明,稳定转染后CD59基因的mRNA和