sirna介导的rnai降低了cd59对补体溶破的抵抗作用

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1、siRNA介导的RNAi降低了CD59对补体溶破的抵抗作用石学香,高美华*,李先平,张蓓,王秋波【摘要】　　目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RTPCR和:ToconstructrebinantvectorsexpressingsiRNAt

2、hattargetCD59geneandastableinhibitcelllineA2780inordertoanalyzetheroleofCD59intheprotectiontoplementmediatedcytolysis.METHODS:The60bpencodedtargetingCD59geneshRNAsequenceidusingliposomeandthestablestrainsedium,CD59mRNAandproteinlevelmRNAandproteinlevel.Dyerelease

3、assaysuggestedthatCD59’sprotectiontoplementmediatedcytolysisdecreased.CONCLUSION:ThesiRNAvectortargetingCD59genecouldconsistentlyinhibitCD59expression.Furthermore,itdecreasedCD59’sprotectionagainstplement.Theseresultsmaypavethemuneescapeoftumorscellsasortherapy．　　

4、〔Keyent　　〔摘要〕目的:构建针对人CD59基因的siRNA表达载体并筛选稳定细胞系,观察CD59基因改变后对补体溶破的抵抗作用的变化,探讨CD59在肿瘤细胞免疫逃逸及相关信号转导通路中的作用。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性CD59基因的重组载体,脂质体法转染A2780细胞,G418筛选建立稳定抑制的细胞克隆,RTPCR和109及兔抗A2780细胞多克隆抗体由本室保存、自制,pSUPERretroneo+gfp质粒由青岛大学医学院罗兵教授惠赠,限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自Fer

5、mentas公司,E.Z.N.A.GelExtractionkit购自美国OMEGA公司,Lipofectamne2000和总RNA提取试剂盒来自Invitrogen公司,AccessRTPCRA1250试剂盒来自Promega公司,RPMI1640和DMEM培养基购自Gibco公司,小鼠抗人CD59抗体(BDPharmingen),辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥公司,Rabbitantiβactin购自北京博奥森公司,BCECF购自Sigma公司,靶向CD59的60bpoligos由上海生

6、物工程技术服务有限公司合成。　　1.2方法　　1.2.1重组载体的构建应用siRNA设计软件及参照pSUPER载体说明书,60nt的寡核苷酸链两端为保护碱基以及HindⅢ和BglⅡ酶切黏性末端,便于和载体连接。5＇端19nt的序列与靶基因同源,另一19nt的序列与其反向互补,其间有9nt的环状序列。此寡核苷酸链经退火形成双链DNA后和pSUPER载体连接。本课题组先前针对CD59mRNA序列设计构建了3条序列发现其中一条能有效抑制CD59的基因的表达（结果另文发表）。本研究中选用这条有效序列（位于CD59mRNA上318bp

7、～336bp）,以高表达CD59的卵巢癌细胞系A2780作为靶细胞,研究其干扰效果。其序列如下:每条链的划线部分序列即为19nt的靶序列。5＇GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3＇;As5＇AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3＇。　　1.2.2重组载体的鉴定分为PCR鉴定、酶切鉴定及最终测序。前者初步验证重组载体的正确性,设计一对引物,扩增产物为

8、包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为395bp的核苷酸,引物序列如下:pSUPERa:5＇CCTTTATCCAGCCCTCACTC3＇,pSUPERs:5＇AGACTGCCTTGGGAAAAGCG3＇。阳性克隆可观察到395bp条带,而空质粒可观察到1318bp条带。用