人突变cd59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测

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1、人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测【关键词】抗原,CD59;卵巢肿瘤；基因；突变［ABSTRACT］ObjectiveTostudytheantiplementaryactivity(ACA)ofutantCD59onovariancancerA2780cells.MethodsThepires1CD59plasmidmunohistochemistrymethodandRTPCRethod.ResultsThepires1CD59plasmidplified.A2780cellsutantCD59lo

2、stitsprotectionofbeingagainsthumanplementparedanCD59isimportanttoitsactivity,prohibitionofthissitemaybeapotentialentactivityandtreattumor.［KEYutationCD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能[1]。首先，它作为补体系统终末阶段的调节蛋白,以同源限制的方式，与C8和（或）C9结合从而抑制攻膜复合物MAC的生成，保护自身正常组织

3、细胞免受补体损伤。其次，GPI锚固的CD59是一个重要的信号转导分子,参与了单核细胞、粒细胞、血小板、T细胞的活化信号转导过程，尤其是作为CD2的配体在T细胞活化中的辅助作用倍受人们的关注。近年来，国外报道已在多种实体肿瘤细胞中，如卵巢、前列腺等发现有CD59分子的过表达，并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关，提示CD59分子的抗补体活性可能与生殖系统肿瘤细胞的逃逸相关[2]。CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点。CD59分子NMR结构显示,抗补体活性区域主要集中于N37～H

4、44之间，推测CD59第40位保守氨基酸可能是CD59分子活性位点[3]。本研究拟用基因转染的方法，将野生型CD59基因及其突变体（40位色氨酸缺失）转染入人卵巢癌细胞A2780中，观察转染后A2780细胞生长状态及40位色氨酸缺失后CD59分子抗补体活性的改变。1材料和方法1.1材料1.1.1质粒、菌株与细胞株人突变CD59cDNA重组PIRES载体（piresM1CD59），其含有一段约500bp的CD59突变基因，即CD59第40位点色氨酸缺失；野生型CD59cDNA重组PIRES载体（pires109由本室保存；

5、卵巢癌细胞A2780由齐鲁医院惠赠。1.1.2主要试剂RPMI1640培养基购自Gibco公司；牛血清购自杭州四季青公司；胰酶和G418均购自Amresco公司；真核表达载体PIRES含有CMV强启动子序列,购自TakaRa公司。限制性内切酶EcoRⅠ购自TakaRa公司；转染试剂LipofectinReagent购自Invitrogen公司；MTT由中国医学科学院血液研究所提供；鼠抗人CD59单克隆抗体购自BD公司；RTPCR试剂盒与总RNA提取试剂Biozol均购自Promega公司。1.2实验方法1.2.1质粒的扩增

6、及鉴定将本室保存的两种重组质粒转化大肠杆菌JM109。碱裂解法小量提取质粒，EcoRⅠ37℃过夜酶切，同时设PIRES空质粒作为阴性对照，酶切产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳，以DNA标准相对分子质量为参照，筛选含重组基因的转化子。阳性克隆ALB扩增菌液划板备用。1.2.2细胞转染及稳定转染细胞系的建立转染试剂为阳离子脂质体LipofectinReagent。在转染前1d，用2.5g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞，取0.5mL加入24孔细胞培养板中37℃过夜培养24h，细胞达到80%～90%融合。取pires1CD

7、59转染A2780细胞，并用空质粒作为阴性对照。转染24h后在含400～800mg/LG418的RPMI1640中培养，2周后挑取单个克隆，连续传代10次，将pires1CD59转染细胞命名为M1A。1.2.3RTPCR检测转染细胞中CD59mRNA的表达提取细胞总RNA。以GAPDH为内参照，设计用于鉴定CD59全长基因的引物。上游引物：5′GGGAATCCAAGGAGGGTC3′；下游引物：5′AATGGAGTCACCAGCAGA3′。针对40位突变位点设计下游引物：5′TGCTCAAACTTACACTTG

8、TTATACACT3′。反应条件为：反转录48℃45min；预变性94℃5min；94℃30s,45℃1min,68℃1min,40个循环；延伸68℃7min。扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳，并通过UVPImageAnalysisSoftin，最后DAB底物显色，梯度乙醇脱水，二甲