人突变cd59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测论文

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1、人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测论文【摘要】目的研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性。方法取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞，G418筛选稳定表达细胞克隆；酶免疫法及RTPCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达；制备抗CD59多克隆抗体，MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性。结果野生型及突变型CD59质粒扩增成功，并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株；与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体

2、的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异。结论CD59的ethodsThepires1CD59plasmidmunohistochemistrymethodandRTPCRethod.ResultsThepires1CD59plasmidplified.A2780cellsutantCD59lostitsprotectionofbeingagainsthumanplementparedanCD59isimportanttoitsactivity,prohibitionofthissitema

3、ybeapotentialentactivityandtreattumor.［KEYutationCD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚固糖蛋白，具有多种重要的免疫功能1。首先，它作为补体系统终末阶段的调节蛋白,以同源限制的方式，与C8和（或）C9结合从而抑制攻膜复合物MAC的生成，保护自身正常组织细胞免受补体损伤。其次.freelresco公司；真核表达载体PIRES含有CMV强启动子序列,购自TakaRa公司。限制性内切酶EcoRⅠ购自TakaRa公司；转染试剂LipofectinR

4、eagent购自Invitrogen公司；MTT由中国医学科学院血液研究所提供；鼠抗人CD59单克隆抗体购自BD公司；RTPCR试剂盒与总RNA提取试剂Biozol均购自Promega公司。1.2实验方法1.2.1质粒的扩增及鉴定将本室保存的两种重组质粒转化大肠杆菌JM109。碱裂解法小量提取质粒，EcoRⅠ37℃过夜酶切，同时设PIRES空质粒作为阴性对照，酶切产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳，以DNA标准相对分子质量为参照，筛选含重组基因的转化子。阳性克隆ALB扩增菌液划板备用。1.2.2细胞转染及稳定转染细

5、胞系的建立转染试剂为阳离子脂质体LipofectinReagent。在转染前1d，用2.5g/L胰酶消化生长状态良好的A2780细胞，取0.5mL加入24孔细胞培养板中37℃过夜培养24h，细胞达到80%～90%融合。取pires1CD59转染A2780细胞，并用空质粒作为阴性对照。转染24h后在含400～800mg/LG418的RPMI1640中培养，2周后挑取单个克隆，连续传代10次，将pires1CD59转染细胞命名为M1A。1.2.3RTPCR检测转染细胞中CD59mRNA的表达提取细胞总RNA。以

6、GAPDH为内参照，设计用于鉴定CD59全长基因的引物。上游引物：5′GGGAATCCAAGGAGGGTC3′；下游引物：5′AATGGAGTCACCAGCAGA3′。针对40位突变位点设计下游引物：5′TGCTCAAACTTACACTTGTTATACACT3′。反应条件为：反转录48℃45min；预变性94℃5min；94℃30s,.freelin,68℃1min,40个循环；延伸68℃7min。扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中电泳，并通过UVPImageAnalysisSoftin，最后DAB底物

7、显色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片后镜下观察。1.2.5兔抗人A2780细胞抗血清的制备应用2.5g/L胰酶消化状态良好的A2780细胞，调整细胞密度至1.6×1011/L，以其免疫家兔，10d后经心脏取血，分离血清，应用细胞凝集试验测定抗体效价为1∶5120，分装，-20℃冻存备用。1.2.6抗补体活性检测用MTT法测细胞增殖率间接反应CD59的抗补体活性。收集细胞，分为空白对照组、1A组以及A2780组、1A+CD59mAb组、A2780+CD59mAb组共7组。除空白对照组以外，每组各孔分别加入兔抗A27

8、80细胞抗血清（终浓度为1∶5120）和新鲜人血清（终体积分数0.08）各1μL，37℃孵育1h。每孔各加入10μL浓度为5g/L的MTT，37℃孵育4h后，弃去上清，加入10μL的DMSO，吹打混匀，振荡溶解15min,酶标仪测波长630nm处吸光度(A)值,计算细胞抑制率。细胞抑制率=1-(实验组平均A值-空白对照组平均A值)/(对照组平均A值-空白对照组平均A值)×