人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定（医学论文）

《人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定（医学论文）》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、人突变CD59的表达.纯化及抗原性鉴定【摘要】目的获得纯化人突变CD59(hmCD59)蛋白，制备其特异性抗体，对纯化产物进行鉴定。方法将含有hmCD59全长序列的重组pALTER质粒，运用脂质体介导法转染CHO细胞,采用SDSPAGE检测hmCD59的表达情况，表达产物经ANTIFLAGM2AffinityGel纯化后制备抗血清，以此抗血清鉴定纯化产物。结果hmCD59在CHO细胞获得表达,ANTIFLAGM2AffinityGel纯化后可获得电泳纯的hmCD59蛋白，hmCD59与小鼠抗hmCD59抗血清具有特异性反应。结论从真核细胞获得了电

2、泳纯并具有抗原性的hmCD59蛋白，为进一步对其进行抗体制备、功能研究及临床应用奠定了基础。【关键词】人突变CD59真核细胞表达纯化抗原性[ABSTRACT]ObjectiveToobtainpurifiedhumanmutantCD59(hmCD59)proteinandtoidentifythepurifiedproductwithspecificantiserumagainsthmCD59protein・MethodsTherecombinantpALTERplasmidcontaininghmCD59cDNAwastransfectedi

3、ntoCHOcellswithpcDNA3bylipofectamine・ExpressionofhmCD59onCHOcellswasdetectedbySDSPAGE・TherecombinantproteinwaspurifiedbyANTIFLAGM2A伍nityGel.TheantiserumwaspreparedwiththepurifiedhmCD59andusedtoidentifythepurifiedhmCD59.ResultshmCD59proteinwaspurifiedbyANTIFLAGM2AffinityGel.Fu

4、rthermore,hmCD59hadspecificreactivitywithmouseantihmCD59antiserum.ConclusionThepurifiedhmCD59proteinhasbeenobtainedsuccessfully,whichlaysthefoundationforpreparingantibody,furtherfunctionalstudyandclinicalapplicationofhmCD59・[KEYWORDS]humanmutantCD59;eukaryoticcellsexpression;

5、purification；antigenicityCD59是一种广泛分布于组织细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚固膜蛋白，相对分子质量较小，只有20000左右，在补体活化通路的不同阶段限制补体活化，成为攻膜复合体(MAC)形成的关键抑制物，从而保护自身正常的组织细胞免受补体损伤El］o国内外研究显示，人CD59糖化后失去抑制MAC的功能［2］,突变人CD59(hmCD59)在高糖环境下更加易于糖化失活,抗补体活性更快降低［3］,MAC沉积增加，内皮释放生长因子，引发糖尿病病人血管增殖［4］。人类糖尿病血管并发症发生的潜在机制仍然不十分清楚，尤其

6、是hmCD59与糖尿病并发症的相关性鲜有报道。本研究报道hmCD59蛋白的表达、提取、纯化及抗原性鉴定，为下一步制备抗hmCD59单克隆抗体并对其进行临床应用研究奠定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1质粒、菌株与细胞株质粒hmCD59PALTER由本室构建保存。pcDNA3由美国哈佛大学提供。CHO细胞株由本室保存。1.1.2主要试剂EcoRI购自宝生物大连有限公司。RPMI1640培养基购自HyClone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。G418选择性抗生素购自于Amresco公司。LipofectamineTM2000为

7、Invitrogen公司产品OANTIFLAGM2AffinityGelFreezerSafe为SigmaAldrich公司产品。Vivaspin2超滤浓缩离心管为Sartorius公司产品。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。HRP标记的羊抗小鼠IgG为北京中山生物技术有限公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。1.2实验方法1.2.1质粒hmCD59PALTER的鉴定将hmCD59PALTER质粒经EcoRI酶切鉴定并经上海生物工程公司测序确认。1.2.2hmCD59在CHO细胞中的表达重组质粒hmCD59PALTER对CHO

8、细胞的转染，参照LipofectamineTM2000的说明书进行。转染后24h将细胞作1:10稀释后传代,48h后加入选择培养液(含有