人突变cd59的表达、纯化及抗原性鉴定

《人突变cd59的表达、纯化及抗原性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、人突变CD59的表达、纯化及抗原性鉴定【关键词】人突变CD59真核细胞表达纯化抗原性［ABSTRACT］ObjectiveToobtainpurifiedhumanmutantCD59(hmCD59)proteinandtoidentifythepurifiedproductagainsthmCD59protein.MethodsTherebinantpALTERplasmidcontaininghmCD59cDNAine.ExpressionofhmCD59onCHOcellsCD59andusedtoidentifythe

2、purifiedhmCD59.ResultshmCD59proteinore,hmCD59hadspecificreactivityouseantihmCD59antiserum.ConclusionThepurifiedhmCD59proteinhasbeenobtainedsuccessfully,CD59.［KEYAC）形成的关键抑制物,从而保护自身正常的组织细胞免受补体损伤［1］。国内外研究显示，人CD59糖化后失去抑制MAC的功能［2］，突变人CD59(hmCD59)在高糖环境下更加易于糖化失活，抗补体活性更快降低

3、［3］，MAC沉积增加，内皮释放生长因子，引发糖尿病病人血管增殖［4］。人类糖尿病血管并发症发生的潜在机制仍然不十分清楚，尤其是hmCD59与糖尿病并发症的相关性鲜有报道。本研究报道hmCD59蛋白的表达、提取、纯化及抗原性鉴定，为下一步制备抗hmCD59单克隆抗体并对其进行临床应用研究奠定基础。1材料和方法1.1材料1.1.1质粒、菌株与细胞株质粒hmCD59PALTER由本室构建保存。pcDNA3由美国哈佛大学提供。CHO细胞株由本室保存。1.1.2主要试剂EcoRⅠ购自宝生物大连有限公司。RPMI1640培养基购自Hy

4、Clone公司。小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司产品。G418选择性抗生素购自于Amresco公司。LipofectamineTM2000为Invitrogen公司产品。ANTIFLAGM2AffinityGelFreezerSafe为SigmaAldrich公司产品。Vivaspin2超滤浓缩离心管为Sartorius公司产品。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品。HRP标记的羊抗小鼠IgG为北京中山生物技术有限公司产品。其他试剂均为国产或进口分析纯。1.2实验方法1.2.1质粒hmCD59PA

5、LTER的鉴定将hmCD59PALTER质粒经EcoRⅠ酶切鉴定并经上海生物工程公司测序确认。1.2.2hmCD59在CHO细胞中的表达重组质粒hmCD59PALTER对CHO细胞的转染,参照LipofectamineTM2000的说明书进行。转染后24h将细胞作1∶10稀释后传代,48h后加入选择培养液(含有800mg/L的G418)筛选阳性克隆2周，挑取单个克隆,继续抗性筛选2周,其阳性克隆的后续培养始终在G418维持剂量(400mg/L)下进行。收集生长状态良好的阳性CHO细胞，裂解后离心取上清以SDS聚丙烯酰胺凝

6、胶电泳（SDSPAGE）鉴定蛋白的表达。1.2.3目的蛋白hmCD59的纯化获取生长良好的107～108个转染CHO细胞，加入细胞裂解液(含50mmol/LTrisHCl,pH7.4,150mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA,体积分数0.01的TRITONX100)10mL,冰上振荡裂解30min后低温离心取上清待用。将ANTIFLAGM2AffinityGel装柱并静置，待填料完全沉降后，用TBS（其中含50mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaCl,pH7.4)冲洗，连续加3次柱体积的0.1mo

7、l/L甘氨酸HCl(pH3.5)洗胶，再以TBS在4℃平衡树脂。加入总蛋白提取物，在重力作用下多次流经亲和柱，保持4℃，控制流量为1mL/min,再用10～20个柱容积的TBS冲洗，去掉未结合的杂蛋白，经磺硫酸检测无蛋白流出。然后用6个1mL的0.1mol/L甘氨酸HCl(pH3.5)进行洗脱，分别收集入6个含有20μL1.0mol/LTris(pH8.0)的管中。1.2.4hmCD59的SDSPAGE鉴定SDSPAGE中使用120g/L的分离胶和50g/L的浓缩胶。将收集的洗脱峰蛋白2mL装入Vivaspin2超滤浓缩离

8、心管中，3000r/min离心12min进行浓缩至浓度为1g/L。取20μL浓缩后样品与等体积2×上样缓冲液混匀后，在沸水浴中加热5min,上样，起始电压为70V。当样品移出浓缩胶与分离胶的分界处时，加大电压到100V至电泳终了，经考马斯亮蓝染色后观察结果。1.2.5小鼠抗h