白杨素对人胃癌sgc7901细胞增殖与凋亡的影响

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1、白杨素对人胃癌SGC7901细胞增殖与凋亡的影响：康颖，刘红光，曾谷清，谷依学【摘要】目的探讨白杨素（Chrysin，ChR）诱导人胃癌SGC7901细胞株凋亡的作用及机制。方法分别用10、20、40、80μM的ChR处理人胃癌细胞株SGC790148h，采用MTT比色法检测ChR对SGC7901细胞的增殖抑制效应；采用丫啶橙（AO）染色、流式细胞术检测ChR诱导SGC7901细胞凋亡的发生；应用TT比色法显示的10~80μM的ChR在体外对人胃癌SGC7901细胞有增殖抑制率为：9.71%~

2、53.64%，该作用呈浓度依赖性；AO染色荧光显微镜观察ChR在体外能诱导人胃癌SGC7901细胞发生凋亡，出现早期凋亡细胞及凋亡小体；流式细胞术检测结果显示：ChR呈浓度依赖性地诱导SGC7901细胞凋亡，凋亡率为2.35%~20.8%；ethodsThecellsofhumangastriccancercelllineSGC7901easuredbyMTTassay.Acridineorange(AO)stainingandfloetry(FCM)iquantificationofprotei

3、nexpressionageanalysis.ResultsSO）溶解配成1mmol/L母液，闭光保存于4℃冰箱中，临用时将此母液稀释至所需浓度。兔抗人Bcl2、Bax、NFκBp65多克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司，相应二抗和化学发光试剂，均购自NEB公司。MTT、DMSO、AO均购自美国Amresco公司。　　1．2细胞培养人胃癌细胞株SGC7901从中南大学湘雅医学院肿瘤研究所引进，培养于含10%灭活小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中

4、,在37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱培养，每2～3天传代。　　1．3增殖抑制率检测SGC7901细胞以3×104/ml的浓度接种于96孔板，每孔加入180μl，待细胞贴壁后加20μl不同浓度ChR，使其终浓度分别为10、20、40、80μM，溶媒对照组加入相同体积含终浓度为0.1%DMSO的完全培养基，每组设6个复孔，处理48h后加入MTT测吸光度值A，计算增殖抑制率，增殖抑制率（%）＝（1－实验组A均值/对照组A均值）×100%，实验重复3次。　　1．4细胞凋亡检测细胞以3×105/瓶接种，24h后

5、换液同步化，24h后分别用终浓度为10、20、40、80μM的ChR、0.1%的DMSO完全培养基处理48h后，收集细胞，实验重复3次。（1）丫啶橙（AO）染色：以PBS悬浮细胞团，调整细胞浓度为1×106，取出95μl细胞悬液与5μl丫啶橙（100μg/ml）混匀后，涂片后镜检拍照。（2）流式细胞术：预冷的PBS洗涤细胞，用4℃的70%乙醇固定24h后，2000r/min离心，以PBS洗1次，重悬于PBS中加入0.5ml经高温处理的无DNA酶活性的RNaseA，使终浓度为500μg/ml，再加入1ml碘

6、化丙啶PI（100μg/ml），轻轻混匀，于室温暗处作用15min后，上机检测。　　1．5Westernblot检测基因表达参照文献[3]进行细胞蛋白质的提取、定量和分离。转膜后先后与1%脱脂奶粉、一抗、过氧化物酶偶联的二抗孵育，暗室内发光、冲洗胶片。扫描胶片，用计算机图像分析系统测定NFκBp65、Bcl2、Bax蛋白条带密度，实验重复3次。　　1．6统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件,组间两两比较采用onewayANOVA方法进行分析，结果用均数±标准差(±s)表示，量效关系采用双变量

7、相关分析，认为P＜0.05具有统计学意义。　　2．2丫啶橙（AO）染色结果对照组细胞形态饱满，细胞质呈绿色，核染色为亮绿色，核形态规则，为圆形或椭圆形；经10、20、40、80μM白杨素作用48h后，部分SGC7901细胞即发生凋亡的形态学改变，见图1，细胞形态接近正常，胞质为绿色略带橘红色的为早期凋亡细胞，数目随浓度升高有说增加，箭头所指呈现凋亡小体。　　2．3流式细胞术检测结果小剂量白杨素（10μM）诱导SGC7901细胞凋亡的作用比较轻微，凋亡率为(2.35±0.66)%，与溶媒对照组比较差异无

8、统计学意义（P＞0.05），随着浓度的升高，凋亡率也增加，20、60、80μM白杨素的诱导凋亡率分别为（5.57±0.96）%、（13.1±1.43）%、（20.8±1.51）%，与溶媒对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。双变量相关分析检测浓度与凋亡率之间存在正相关（r=0.988，P=0.002），即存在量效关系。　　2．4NFκBp65、Bcl2、Bax蛋白表达经10、20、40、80μMChR处理SG