peg介导的黑附球菌遗传转化体系的建立

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1、PEG介导的黑附球菌遗传转化体系的建张雷刚罗淑芬宏胜胡花丽李鹏霞江苏省农业科学院农产品加工研宄所艺产品采后处理工程实验室江苏省农业科学院以生防真菌黑附球菌原生质体为受体、潮霉素抗性基因（hph）为筛选标记，应用PEG介导法进行了遗传转化体系的研究。潮霉素敏感性测试结果表明，黑附球菌对潮霉素的耐受浓度为50mg/LoPEG介导的黑附球菌原生质体最佳遗传转化体系为:30°C下用2%裂解酶酶解黑附球菌菌丝2h，过滤收集原生质体，经MTC清洗重悬后将质粒pYFll-hph转化黑附球菌原生质体，在RM培养基中混匀再

2、生;经潮霉素药剂筛选和PCR验证，表明外源基因hph已转入到黑附球菌中并获得稳定表达。木实验成功地建立了稳定的PEG介导的黑附球菌遗传转化体系，为研宄其代谢途径、生防机制及构建工程菌株提供了技术保障。关键词：PEG介导;.黑附球菌;遗传转化;原生质体;T程菌株;但新鲜果蔬从采收到出售，由于自身生理代谢和病原生物侵染，致使流通过程屮损耗相当严重，其屮侵染性病害是引起品质劣变的重耍原因。我国每年果蔬从田间到餐桌损失率高达25%-30%，而发达国家则控制在5%以下(黄应维等2013)。此外，扩展青霉、黄曲霉等微

3、生物侵染致病的同时还会分泌毒素，引起食品安全问题(Schatzmayretal.2006)。因此，采用生物保鲜技术防止果蔬腐烂变质的研究和开发显得更为迫切和重要。A前生物保鲜技术主要包括微生物拮抗菌、微生物次级代谢产物、抗菌肽、天然提取物等。利用生防菌对病原菌的拮抗作用控制果蔬采后病害，具有高效安全的优点，是当前果蔬储藏与保鲜行业的研宄热点(李鹏霞和张兴2006;黄应维等2013;王刚霞等2014)o黑附球菌Epicoccumnigrum属半知菌亚门附球菌属，广泛分布于空气、土壤及各种植物组织表面，是一种

4、防治农作物病害较为理想的生防菌(夏簡琴2012)。Larcnaetal.(2005)利用黑附球菌的分生孢子悬浮液能够有效防治桃褐腐病;李扬等(2010)筛选出了对致病疫霉具有拮抗作用的黑附球菌，该菌株分生孢子悬浮液对马铃薯晚疫病有较好的保护作用;Alcocketal.(2015)发现黑附球菌代谢产物中的epirodin对灰霉病菌具有强烈抑制效果;Fdvaro&Araiijo(2012)从甘鹿中分离到一株黑附球菌，其产生的抗真菌物质具有促进根部发育和控制病害的作用。随着基因组学和生物工程技术的发展，遗传转化

5、成为人们进行菌种改造或基因功能研究的一种主要技术(Weldetal.2006)。生防菌次级代谢产物对病原菌有强烈的抑制作用，但大多数野生型生防菌株生活力一般，在发酵液中累积活性产物的能力很差，同时还会形成很多影响防效的副产物。因此，通过基因工程技术提高活性成分产量、减少副产物产生，从而提高其生防效果对于实际应用具有重要意义。另外，从分子水平对苏生防机制进行深入研究，明确生防菌与病原菌、植物间的互作机制同样需要借助基因操作手段。与近缘物种毛壳霉相比，黑附球菌菌丝生长速率慢，气生菌丝更少，后期产生液状分泌物，

6、表而不产生子囊孢子，(余应建2006;陈超2014)，这种生长特性使其遗传转化体系具有一定特殊性。关于毛壳霉的遗传转化体系已有较多研宄，括原生质体转化(陈振明等2001)、农杆菌介导的转化(高兴喜和杨谦2005)等，前者以分生孢子萌发产生的幼殖体为原生质体制备材料，后者以分生孢子为对象直接进行转化。但目前尚未建立黑附球菌的遗传转化体系，制约了其分子机制层而的研允，不能充分发挥其潜在的生防效果。木研宄以潮霉素抗性基因hph作为筛选标记，通过控制原生质体制备、再生培养基的选择等条件建立PEG介导的黑附球菌遗传

7、转化体系，确保了获得大量表达潮霉素抗性蛋Q且稳定遗传的转化菌株，该遗传转化方法的建立为针对性地进行黑附球菌基因改造、提高其生防效果提供了技术支持，同吋也有利于对其生防机理进行研究。1材料与方法1.1材料和试剂■■扇S9I双元表达载体pYFll-hph由南京农业大学侯毅平副教授馈赠，该质粒带有潮霉素B磯酸转移酶基因(hygromycinBphosphotransferase,hph),可作为随机插入突变体的筛选标记;黑附球菌E.nigrumH5菌株:分离自哈密瓜病变组织，单孢分离后经分子和形态学鉴定，并保藏

8、在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCNo.9713)。1.1.2试剂：本实验所用的PCRMix、DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒等购自南京诺唯赞生物科技有限公司；per引物合成及测序交由英潍捷基(上海)贸易有限公司完成;裂解酶(lysingenzyme)、潮霉素等购自Sigma公司；溶壁酶(lywallzyme)购自广东省微生物研究所;蜗中酶(snailase)购自北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂均为国