根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系的建立-论文.pdf

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1、生物技术通报·研究报告·BIoTECHNoLoGYBULLETIN2014年第6期根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系的建立崔倩李洁刘晓光(天津市工业微生物重点实验室工业发酵微生物教育部重点实验室天津科技大学生物工程学院天津300457)摘要：赭曲霉在工业上用于甾体C．1la羟基化。为了对现有赭曲霉生产茵株进行遗传改造，以农杆菌LBA4404作为侵染菌株，以赭曲霉(TCCC41060)作为受体菌株，以潮霉素B基因作为筛选标记，成功建立了根癌农杆菌介导的赭曲霉遗传转化体系并对其转化效率的主要影响因素，如农杆菌浓度、孢子浓度、共培养时间和温度等进行了分析。在最佳条件下，转化效

2、率可以达到57个转化子／l个分生孢子。随机挑选的8个阳性转化子lO代连续培养结果表明所获得的转化子能稳定遗传。该遗传转化体系的建立为赭曲霉菌株的定向遗传改造提供了重要的操作平台。关键词：赭曲霉根癌农杆菌转化体系EstablishmentofAgrobacteriumtumefaciens—mediatedTransformationSystemofAspergillusochraceusCuiQianLiJieLiuXiaoguang(n口nnKeyLaboratoryofIndustrialMicrobiology，KeyLaboratoryofIndustrialF

3、ermentationMicrobiologyMin~tryofEducmion，theCollegeoJ’Biotechnology，TianjinUniversityofScience&Technology，Tianjin300457)Abstract：FilamentousfungusAspergillusochFacel~TCCC41060isanindustrialstrainusedformicrobialsteroidC11-ahydroxylation．InordertocreategenetictoolsforA．ochraceus，thetransf

4、ormationsystemofA．ochraceuswasestablishedusingAgrobacteriumtumefaciens-mediatedsystem(ATMT)．A．tumefaciensLBA4404wasusedastheinfectivestrainandhygromycinBgeneastheselectionmarker．ThemajorfactorsafectingthetransformationefficiencyincludingtheconcentrationsofA．tumefacienscellandA．ochraceta~

5、spores，co-culturetime，andCO-culturetemperaturewereinvestigated．Underthebestconditions，thetransformationeficiencyof57transformants／107sporesWasobtained．A．ochraceustransfonnantswereconfirmedbyPCRamplification．Randomlyselected8transformantswereshowntobegeneticallystableafter10roundsofsucces

6、sivecultivation．ResultsindicatedthisATMTtransformationsystemwouldprovideimportantmeansforthedirectedgeneticmanipulationofthisimportantindustrialstrainA．ochraceusTCCC41060．Keywords：Aergf2ochraceusAgrobacteriumtumefaciensTransformantionsystem赭曲霉(Aspergillusochraceus)，属于壳霉目，赭曲霉中合成赭曲霉毒素A的pb基

7、因J。本研究杯霉科，在自然界中分布广泛。目前工业上主要应意在建立一个高效的赭曲霉遗传转化体系，从而为用赭曲霉进行甾体类药物的C一1la羟基化反应，如生产菌株的定向遗传改造奠定基础。制备心血管药物C．1la羟基化坎利酮⋯。若要进一目前已报道的丝状真菌的DNA转化方法主要有步提高赭曲霉对甾体类药物的催化效率，需要从发CaClJPEG转化法J、电击转化法'、基因枪酵条件优化和菌株改造两个方面进行研究。到目前转化法_3’、限制性内切酶介导的转化法"'、农为止，有关赭曲霉催化甾体类药物发酵条件优化的杆菌介导转化法(Agrobacteriumtume