根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展

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1、万方数据第22卷第5期中国生物工程杂志JouRNALoFcHINEsEBIoTEcHNoLoGY2002年10月根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展”翟篓黧技磐重耋=∞3A(西南农业大学生物技术中心重庆400716)u、IS△摘要根癌农杆茼介导的真茵遗传转化是近年来发展的一种新方法，与其它方法相比，该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。目前，在根癌农杆茵介导下已实现了多个属种真茼的遗传转化，显示出良好的应用前景。综述了根癌农杆茵介导真菌遗传转化的转化机理和rr．刚A在真菌细胞中的存在方式等方面的研宄结果，并展望这一方法的应

2、用前景。关键词根癌农杆茵真菌遗传转化真菌在自然界具有重要的地位，它是不同生态环境中的最初分解者之一，同时真菌在工业、农业、食品行业和医药等领域应用十分广泛。如构巢曲霉(^{胛，州fw鲫弛mo^)由于具有很强的生产同源、异源蛋白的能力、GRAs(胛聊mZrecog“洫d∞s啦竹)和成熟的发酵工艺等特点而广泛应用于食品和食品加工行业。杀虫真菌白僵菌和绿僵菌广泛应用于农业和卫生害虫防治。但是，从自然界直接分离的菌株和通过常规育种得到的菌株在多种性状上并不能满足人们的需要，至于通过常规方法用真菌生产异源蛋白更是难以实现。真菌遗传转化技术的出现为解决

3、这些问题提供了有效的途径。自从1973年Mishm等首次报道真菌遗传转化以来”‘21，真菌特别是酵母菌的遗传转化取得了很大的进展。但目前广泛采用的真菌转化方法主要有PEG．cack法、电激法和基因枪法，这些方法大都以原生质体为受体。除了制备原生质体过程复杂、重复性差外，这些方法最大的问题在于转化子不稳定，转化效率低”1。其中转化效率低已成为制约真菌遗传转化的瓶颈问题一-。针对这一问题．许多学者提出了一些改进方法和新方法，其中最有效的是根癌农杆菌介导的真菌*国家高技术研究发展计划(拍3)资助项目(批准号：200l^^214051))**通讯作

4、者，联系电话：023—68251883．电于信箱：pely柚@mmen遗传转化。根癌农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将T．DNA转入植物细胞并整合进植物的基因组，最终导致肿瘤的发生。在大肠杆菌与酵母菌能够通过接合的方式将前者的质粒转移到后者”’和农杆菌转化植物等现象的启发下．Bundock等人尝试用根癌农杆菌介导酵母菌遗传转化，并取得了成功”。。进一步研究发现根癌农杆菌介导的真菌遗传转化法具有效率高，成本低，操作方便和重复性好等特点”。1。1根癌农杆菌介导的遗传转化的真菌种类自1995年Bundock等首

5、次成功进行根癌农杆菌介导酵母菌的遗传转化以来，到目前为止已在10多种真菌上取得成功。已转化成功的真菌见表1。2根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理为了方便说明根癌农杆菌介导真菌遗传转化的机理，有必要将其介导植物遗传转化的机理作一介绍。根癌农杆菌将T—DNA转移进植物细胞主要是依赖于Ti质粒上一系列vir基因的表达。virA基因编码的蛋白A结合植物伤口释放的单糖和酚类物质后自身激化，其保守的组氨酸残基被磷酸化。磷酸化的蛋白A将其上的磷酸万方数据第5期方卫国等：根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展4l盐转化到viIc蛋白的天冬氨酸残基上，激活vi以

6、蛋白。激活的virG结合到vir基因启动子的特定区域，打开virB、c、D、EH等几个基因的表达。其中virDl，virD2共同作用下，切开T_DNA的边界区域，virD2蛋白在切割后还结合在T-DNA5’端，其c一端的N【ss序列(nucleartar辨tin异sequences)将T_DNA导向植物细胞。virc基因通过结合在RB附近的非T—DNA区域以增强virD2对RB的切割效率。单链结合蛋白virE结合到T．DNA单链上形成T-DNA复合体(T—DNAco唧lexs)，在virB的作用下T—DNA复合体通过农杆菌细胞膜进入植物细胞

7、后整合到植物的基因组。virF和virH基因对转化不同植物品种时发挥不同的作用。另外，根癌农杆菌基因组的chvA、chvB、“oc等毒性基因在根癌农杆菌介导的植物遗传转化中起一定作用”1。哀l目前利用根癌农杆菌介导的转化成功获得转基因曹株的真蕾与根癌农杆菌介导植物遗传转化相似，它介导真菌遗传转化同样需要vir基因的表达。只有在根癌农杆菌与受体细胞的共培养基中含有乙酰丁香酮(Asacelosy打n舶ne)时转化才能发生。virA、vi以、virDl，virD2、virE、virB和virC中任何一个基因发生突变都没有转化现象的发生。同时T．D

8、NA的左右边界任何一个发生缺失T．DNA都不能转移。但是virF和virH的突变体的转化效率改变不明显”⋯。Pien等人发现根癌农杆菌染色体毒性基因(chvA、chvB和exoc