根癌农杆菌介导凝集素基因转化柑橘遗传体系的研究

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1、华中农业大学硕士学位论文根癌农杆菌介导凝集素基因转化柑橘遗传体系的研究姓名：何温红申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：丁芳201206根癌农杆菌介导凝集素基因转化柑橘遗传体系的研究摘要本试验采用农杆菌介导方法，以模式植物烟草(Nicotianabenthamiana)和芸香科植物甜橙(Citrussinensis)、夏橙(CitrusNatsudaidaiHayata)为材料，成功建立了凝集素基因的遗传转化技术体系，取得的主要试验结果如下：l枳壳凝集素基因克隆及分析，采用TA克隆法获得了枳壳凝集素基因完整ORF序列，其全长为801bp，编码一个267个氨基酸的开放阅读框。将该基因

2、插入原核表达载体pET-28a(+)，获得重组载体pET-28a(+)．PTA．NHl5，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在1mmoFLIPTG诱导下高效表达，SDS．PAGE分析结果表明，pET-28a(+)．PTA．NHl5基因在大肠杆菌中成功地进行了表达，大小为29kDa。2枳壳凝集素基因植物表达载体构建根据植物表达载体pCAMBIAl301S上的多克隆位点设计相应引物，利用带有相应酶切位点的引物扩增得到编码完整开放阅读框的枳壳凝集素基因，电击转化农杆菌EHAl05感受态细胞，经双酶切验证，该基因已成功构建到了植物表达载体pCAMBIAl301S上。3枳壳及外源半夏凝集素基因遗传转

3、化技术体系建立通过试验条件的优化，最终分别建立了烟草(Nicotianabenthamiana)和柑橘(Citrus)的凝集素基因遗传转化技术体系：试验结果表明，烟草叶盘在农杆菌侵染液中侵染10min，MS(附加100mMol／LAS)共培养基上共培养2d，MS选择培养基(附加400mg／L头孢霉素Cef+卡那霉素Kan50mg／L)中进行选择培养时，抗性芽再生率较高，为92．5％，抗性芽在1／2MS+200mg／Lcef+0．3mgmNAA生根培养基中成功诱导生根；柑橘茎段在农杆菌侵染液中侵染30min，MT共培养基上共培养3d，MT选择培养基(附加Kan50mg／L)上进行选择培养时

4、，抗性芽再生率较高为88．2％，且抗性芽在1／2MT(附加活性炭0．05g／L)培养基上生根率较高，为6．33％。经潮霉素(Hyb)抗性筛选后，对PCR鉴定为阳性的再生植株进行Southernblot验证，目前已得到转枳壳凝集素PoncirusTrifoliataAgglutinin的烟草植株为15株，柑橘植株5株，转半夏凝集素PinelliaTemataAgglutimn的烟草植株9株，柑橘2株。关键词：柑橘，凝集素基因，SDS．PAGE，农杆菌介导法，Southemblot华中农业大学2012届硕士研究生学位论文ABSTRACTGenetictransformationsystems

5、ofcitrusarenecessaryrequirementfortlleintroductionofusefulgenesintospecificcultivars．ThisresearchpresentsaprotocolforinvitroregenerationandgenetictransformationofC．sinensisandCitrusNatsudaidaiHayatausingstermsegmentsfromthecitrusseedlingsasexplants．TheobtainedresultsareaSfollowings：1ThePoncirusTr

6、ifoliataAgglutinin(PTA)genecloningandanalysisThePoncirusTrifoliataAgglutiningeneWasobtainedbytheTAcloning，whichis801bpandencodesaproteinof267aminoacids．ThecompleteOpenReadingFrame(ORF)ofPTAWasinsertedintoprokaryoticexpressionvectorpET-28a(+)．TherecombinantplasmidsweredenotedaspET-28a-PTA-NH15andi

7、ntroducedintoE．colistrainBL21(DE3)．RecombinatPTAWasinducedby1mMisopropyl-p．D．thiogalactoside(IPTG)．SDS．PAGEanalvsesindicatedthatpET-28a-PTA-NH15geneWasexpressedeffectivelyundertheinductionof1mmol／LIPTGandmolecularweigh