根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究

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1、根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研摘要：以小麦栽培品种郑麦9023成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料，通过农杆菌菌株GV3101将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。考查了MS培养基中NH4N03浓度对组织培养的影响，以及高渗处理对转化过程的作用。结果显示，2・5倍的NH4NO3浓度可明显提高愈伤组织再生率，高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。经抗性筛选和PCR鉴定，共得到了4株转基因小麦植株，平均转化效率为0・18%。关键词：小麦；成熟胚；农杆菌；转化中图分类号：s512.1文献标识码：A文章编号:0439-811417-3637-03Agrobacterium—media

2、TransformationofWheatMatLIYan—chuanAbstract：Agrobacterium—transformationwasconductedbyusingeXp1antwheatmaturemediatedAgrobacteroumstrainGV3101sderivedfromembryosofZhengmai9023asreceptor；andthetransformationprocesswasoptimized・TheeffectofNH4N03concentrationandosmotictreatmentwasstudied.Theresu1ts

3、howedthat2.5timesofNH4N03concentrationincal1usinductionmediumandosmotictreatmentcouldincreasetheregenerationrateofcallus・AccordingtotheresistanceidentificationandPCRidentification,4transgenicwheatplantswereobtainedwiththeaveragetransformationefficiencyof0・18%.Keywords：wheat；matureembryo；Agrobact

4、erium；transformation1997年，Cheng等［1］首次用农杆菌介导法获得可育的转基因小麦植株。几年后，夏光敏等［2］、叶兴国等［3］也分别报道利用农杆菌法获得了转基因小麦植株。随后越来越多的研究机构对农杆菌介导的小麦遗传转化方法作了更加细致与深入的研究［4-8］,使得该方法的转化效率不断提高。但上述报道大多用小麦幼胚及其诱导产生的愈伤组织作为转化受体，虽然小麦幼胚再生能力强，但取材在时间和空间上受到很大限制，适宜转化的生理状态难以掌握，转化周期也比较长。相比幼胚，成熟胚取材方便,生理状态一致，不受生长季节限制，是组织培养和遗传转化理想的外植体。本研究以小麦成熟胚诱导

5、的愈伤组织为转化受体，在已有研究基础上［9—11］选择根癌农杆菌介导小麦遗传转化的几个重要影响因素，进行比较与优化，旨在为进一步建立和优化根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化体系奠定基础。1材料与方法1.1试验材料小麦品种郑麦9023以及质粒pTRAkc-BAR-UT-Rs-D2和根癌农杆菌GV3101均由华中农业大学麦类分子生物学实验室提供。1.2试验方法1.2.1培养基诱导培养基含MS基本培养基［12］、肌醇100mg/L、天门冬氨酸134mg/L、脯氨酸115mg/L.MES1.95g/L.2,4-D2mg/L.麦芽糖40g/L、植物凝胶5g/L；同时设计了3种NH4N03浓度修饰

6、的诱导培养基。浸染培养基、分化筛选培养基、生根筛选培养基及生根壮苗培养基等参照文献配制［9,13］。1.2.2种子表面消毒及预处理选取成熟饱满、颜色和大小相对一致的小麦成熟种子，用70%的乙醇浸泡5min,无菌水冲洗2〜3次，再经0.1%HgC12浸泡15min,无菌水冲洗6〜8次后，置于含8mg/L2,4-D溶液的无菌三角瓶中33°C浸泡5h。预处理后的种子用70%的乙醇浸泡1min,无菌水冲洗2〜3次，再经0.1%的日gCl2浸泡5min,无菌水冲洗3〜4次。1.2.3愈伤组织的诱导用左手拿锡子夹住已浸泡过的成熟种子无胚的一端，右手拿手术刀将成熟胚纵切成两半后，将胚剥出，切面向下放

7、置于诱导培养基上，°C暗培养1・2・4农杆菌接种菌液的准备挑取含目的质粒的农杆菌GV3101单菌落于10mL含25mg/Lkan>100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEE培养基中，28°C.220r/min暗培养过夜。吸取1mL培养物转入50mL含25mg/Lkan、100mg/Lrif和100mg/Lcab的YEB培养基中，28°C>220r/min继续暗培养至0D600nm=0・8〜1.0。将菌液转至无菌离心管中,4500r/mi