根癌农杆菌介导的反义waxy基因对籼稻遗传转化的研究

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1、东北农业大学硕士学位论文根癌农杆菌介导的反义waxy基因对籼稻遗传转化的研究姓名：刘南南申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：朱延明2003.5.1摘要车研究以广东地区三个常规籼稻品种和两个不育系品种为材料，系统地探讨了影响籼稻植株再生体系的主要因素，建立了稳定，高效的籼稻植株再生体系；构建了适台于农杆菌介导法转化籼稻的植物表达载体：应用正交实验设计探讨了农杆菌介导法遗传转化的主要影响因素，建立了籼稻的遗传转化体系；将反义水稻蜡质(waxy)基因和GUS基因的融台基因导入籼稻，并进行了初步检测。(本研究主要结论如下：＼1．反义waxy基因的植物表达载体的构建本实验构建了一

2、个植物表达载体卡盒和一个植物表达载体，植物表选载体卡盒p13WG3．1含有waxy基因上游调控序列调控的GUS基因，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因，可作预实验使用；植物表达载体p13W4中的反义waxy-GUS融合基因由waxy基因上游调控序列调控，作为目的基因转化的材料。2．籼稻植株再生体系的建立a．2，4-D浓度对愈伤组织诱导的影响探讨了2，4一D浓度为卜5m∥I．对愈伤组织诱导的影响，各品种均在2，4-D浓度为2mgjL的NB培养基上愈伤组织诱导率达到最高，分别为粤香占79．17％、粤丰占62．50％、培矮64S12．50％、GD-1S70．00％、粤泰B95．8

3、3％。b．基因型对愈伤组织诱导的影响五个品种在相同的2，4-D浓度下愈伤组织诱导辜存在显著差异，最高的为粤泰B95．83％，最低的为培矮64S12．50％。c．接种方式对愈伤组织诱导的影响采用平放和斜插两种接种方式，平放方式好于斜插方式，愈伤组织诱导率最太差异可达60％。d．培养基成分对培矮64S愈伤组织诱导的影响对愈伤组织诱导事较低的不育系品种培矮64S，通过对基本培养基种类、有机物的添加、有机碳源的使用、植物生长调节剂及微量元素的调节的探讨，最终确定培矮64S愈伤组织诱导培养基为：MB+2，4-D2mg／L+BA0．5rag／L+麦芽塘309／L，愈伤组织诱导率可达56

4、．48％。e．影响不定芽分化的因素采用二步分化法，对愈伤组织进行预分化处理和干燥处理，及通过调节培养基的渗透压使不定芽分化率大大提高，五个品种不定芽的分化率存在差异，均在80％左右。f．低浓度2，4-D光下诱导愈伤组织快速成苗低浓度2，4-D光下诱导的愈伤组织直接转入分化培养基中可一次直接分化，分V东北农业大学理学硕士学位论文化率在80％以上，大大缩短了培养周期。3．农杆菌介导的遗传转化体系的建立a．筛选压力的确定确定了五个品种的愈伤组织的潮霉素筛选浓度为20mg／L；四个品种的成熟胚的潮霉素筛选浓度为10rag／L；四个品种的种子萌发的潮霉素筛选浓度为150rag．／L。

5、b．除苗剂浓度的确定除菌剂选用先锋霉素，实验0-600mg／L先锋霉素对农杆菌的抑制作用，晟后确定除菌浓度为500rrI叽。。c不同基因型对遗传转化效率的影响不同基因型的GUS基因瞬时表达率存在差异，分别为粤香占17．65％、粤丰占25．88％、培矮64S12．70％、GD-1S49．30％。d、影响遗传转化效率的主要因素的优化用正交实验设计探讨了农杆菌转化籼稻愈伤组织过程中的其它影响因素，确定的最优实验组合为：侵染菌液浓度为OD600=1．0，共培养缓冲介质为NB培养基，共培养时AS的添加浓度为300p．mol／L，共培养时添加109el葡萄糖，侵染方法采用不振荡法，愈伤

6、组织预培养时不添加As，共培养pH值为5．8．共培养时问为3天，侵染时问为30分钟。e，GUS检测四个品种的转化愈伤组织经GUS组织化学染色分析，均检测到waxy基因上游调控序列调控的反义waxy和GUS融合基因的表达，初步证实目的基因已转入籼稻愈伤组织中。f初步尝试了农杆菌介导法转化籼稻花药和农杆菌介鄹去与种子浸泡法相结合转化籼稻成熟胚，取得了一定进展，尚需进一步探讨。r，／关键词籼稻；农杆菌介导；反义waxy基因：植株再生：遗传转化StudiesontransformationofantisensewaxygeneintoindicaricebyAgrobacteriu

7、mtumfacienceAbstractInthisresearch、threevarietiesofInd／cariceandtwosterileIineswerechosenasthematerials．ThefactorsaffectingregenerationwerestudiedsystematicallyandsteadyregenerationsystemWaSesrablished。AplantexpressionvectorusedforthetransformationofIndicarice