农杆菌介导黄曲霉菌遗传转化体系的初步建立

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1、独创性声明本人声巧所呈的学位论文是本人在导师指导下进行的硏究工作及取得的硏究成果。据我所知？，除了文中特則加碌注和致谢的地方外，也不包含为，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的硏究成果获得安激农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我…同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表巧谢意。学位论文作者签名：／嘴特签字日期；户论年《月３日学位论文腹权使用授极书本学位论文作者完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留井向国家有关部口或机构送交论文的复印件和

2、电子文件，允许论文被查飼和借圓。本人授权安徽农业大学可Ｕｉ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，收录到《中国学位论＇》＾、汇编文全文数据库，可｜＾１采用影巧、缩印或扫描等复制手段保存学位论文。（，向社会公众提供信息服务保密的学位论文在解密后适用本授极书）。学位论文作者签名指导教师签名；讀夺：铜巧签字日期；年《巧３日签字日期；年（月Ｊ）日学位论文作者毕业后去向：工作单位；电话；；邮编通信地址；摘要黄曲霉菌(Aspergillusflavus)是一种腐生型植物病原真菌，其

3、次级代谢物黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFB1)是现如今人类研究发现的具有强致癌性的真菌毒素。黄曲霉菌可侵染玉米、花生、大米等农作物种子并导致相关农产品霉变，严重危害人和动物的健康。了解黄曲霉菌致病的分子机理对预防作物种子霉变具有重要意义。农杆菌介导的遗传转化（ATMT）已成为真菌功能基因组研究的有力工具。本研究采用ATMT技术对黄曲霉菌进行遗传转化，主要结果如下：1.通过黄曲霉原始菌株对不同抗生素的敏感性实验，确定了农杆菌介导转化过6程中以博来霉素为抗性筛选剂，100μg/mL博来霉素可完全抑制1×10个/mL浓度的黄曲霉孢子。经过农

4、杆菌抑菌实验，确定了在筛选过程中头孢噻肟钠（Cef）的最适浓度为300μg/mL。2.为构建适合于黄曲霉菌遗传转化的双元表达载体pDHBle，首先对pAN7-1载体进行改造，将受控于gpdA启动子和trpC终止子的潮霉素抗性基因替换以博来霉素抗性基因（ble），构建成pANBle载体；再将pANBle载体中含ble基因的表达盒PgpdA-ble-TtrpC插入pDHt载体，构建成双元表达载体pDHBle。3.本研究以黄曲霉孢子为材料制备原生质体并对影响原生质体制备的酶浓度、酶解时间、酶解温度等条件进行了优化，其最优条件为：黄曲霉孢子在酶液浓

5、度为纤维素酶∶蜗牛酶∶溶壁酶=1.5%∶∶1.5%1.5%，30℃酶解3h，原生质体制备率高达97.3%，再生率达89.2%。为农杆菌介导黄曲霉原生质体提供了可靠的实验材料。4.初步建立了农杆菌介导黄曲霉菌转化体系。探讨了不同共培养温度、时间、农杆菌浓度和不同的受体材料对农杆菌介导黄曲霉菌遗传转化体系的影响，结果表5明，当农杆菌OD600值在0.5，孢子浓度为1×10个/mL，共培养温度为22℃，共培养2d时，获得的转化效率较高。以原生质体为受体材料的遗传转化正在进行中。5.通过PCR对获得的转化子进行验证。根据转化子上已知ble基因的上下

6、游引物进行PCR，将检测结果为阳性的转化子接种于含100μg/mL博来霉素的SM培养基上，30℃连续培养6代后进行转化子的遗传稳定性检测，结果表明，PCR检测结果为阳性的转化子，继代培养后仍可检测到ble基因，遗传稳定性良好。综上所述，本文构建了以ble为抗性筛选标记基因的双元表达载体，通过ATMT法首次对黄曲霉菌进行遗传转化，获得了阳性转化子，初步建立了农杆菌介导黄曲霉菌遗传转化体系，为后续的T-DNA插入突变体库的构建及黄曲霉菌致病相关功能基因的研究奠定了基础。关键词：黄曲霉菌，农杆菌介导的遗传转化，双元表达载体IAbstractThe

7、plantpathogenicfungusAspergillusflavusdisplaysawidehostrangesuchasseedsofmaize,peanutsandrice,andposeserioushealthhazardstohumansanddomesticanimalsbyproducingaflatoxins(AF),themosttoxicandcarcinogenicsecondarymetabolites.Understandingofthemolecularbasisofthisdiseaseisbenef

8、icialforpreventingitscolonizationincropseeds.TheAgrobacteriumtumefaciens-mediatedtransfor