小麦农杆菌介导不同遗传转化体系的建立及比较研究

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1、中国农业科学院硕士学位论文小麦农杆菌介导不同遗传转化体系的建立及比较研究姓名：杨云霞申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：董志强;赵明20050901第一章绪论1．1国内外研究现状1．1．1小麦基因工程技术研究进展基冈1。程是在七十年代后期发展起来的，它是通过基因的克隆与分离、基因的修饰与表达载体的构建将外源目的基因转入生物体，对生物进行遗传转化的技术。1973年collen等人通过DNA体外重组，实现了细菌间性状的转移，这标志着基因工程的诞生，在植物界已有抗虫的玉米、棉花，抗除草剂的大豆、延熟的番茄等转基因作物，到2002年转

2、基因植物的种植面积已达5870万公顷。小麦属异源六倍体植物，主要存在基因组大，基因调控困难，由小麦不同的外植体诱导的愈伤组织普遍存在成愈率低、愈伤胚性差、分化率低．基因型依赖性大，转化细胞再生困难等问题。小麦是举世公认最难转化的作物，其遗传转化研究基本上还处在建立和优化体系阶段。因此虽然作为主要的粮食作物，但是世界上小麦组织培养和转基因研究水平远远低于水稻、玉米、棉花、大豆等作物。当前在小麦的遗传转化体系中所用的转化方法有基因枪法、根癌农杆菌介导法、花粉管通道法、原生质体法，比较成熟的方法是基因枪法，农杆菌介导法处于探讨和优化阶段。进

3、一步完善现有基因导入技术，建立适合于我国小麦品种基因型的高效可靠的遗传转化技术，是一项1F常重要的工作。选择适宜的小麦基因型，研究小麦组织培养条件和影响植株再生频率的因素是小麦基田转化研究的重要课题。小麦的基因克隆研究主要集中在品质、抗病、抗逆性、春化、雄性不育基因等儿个方面，但还没有有关将有高光合效率的Ct植物稗草PEPc转入小麦的报导。当前小麦的遗传转化可用的外植体有：花药、幼穗、幼胚、成熟胚、茎切段、子叶切片、下胚轴切段、小麦叶片等，当前报导的通过组织培养途径转化成功的事例中不管是基因枪法还是农杆菌介导法多为以幼胚作外植体进行的

4、。1．1。1，1小麦基因工程中用于转化的基因小麦的基因克隆研究主要集中在品质、抗病、抗逆性、春化、雄性不育基因等几个方面。住品质方面，已克隆了编码小麦高、低分子量谷蛋白亚基的基因、小麦淀粉合成酶基因及编码黑麦碱的基因；在抗病、抗逆性方面，已克隆了6个与白粉病有关的cElNA、几丁质酶和沙1，3．葡聚糖酶基因、抗小麦根节线虫摹因、盐胁迫应答基因、水分胁迫诱导基因、与重金属解毒有关的基闲；另外，还克隆了小麦叶绿体基因组中与光合作用有关的psbA基因和与春化有关的基因vrc79、vrc54、Vrc203、vrcl7、vrc28等。在小麦中还

5、克隆到一个GTP结合蛋白的cDNA克隆、EIF转录因子的cDNA克隆及异构酶基因家族F日3P73基因的启动子序列(李根英。2003)。雄性不育基因(deBlockM，DebrouwerDMoensT1997)、兔防御素基因(郭殿京，付荣昭，1999，B1echlAE，AndersonnOD，1996)、高分子量麦谷蛋白基因(BIechlAE，AndersonnOD，J996)、病毒外壳蛋白(cP)基因(K删atnes，soIlllA，MnouadrovA．1996)、雪花莲杀虫凝集素(GNA)基因l中国农业科学院硕上学位论文第一章绪论

6、(stogerE，wlIliamss，christouP1999)大麦胰蛋白酶抑制剂BTI．cMe)基因(AltpeterF，Diazl，McAusIaneH．1999)、抗自粉病酶(VstI)基因(梁辉，郑近。1999)、大麦种子核糖滞活蛋白(R1P)基冈(BieraS，PotrkusI，FunereL2000)、甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基冈(GuoBH(郭北海)，zhangYM(张艳敏)2000)、菜豆几丁质酶基因(LiuwH(刘伟华)、LiWx(李文雄)，2003)、水稻JLr质酶基因(郝建国，李晶，2004)。1．1．1。2

7、溺前的主要转化方法基因枪(blollstionsTr冀n8for

8、Ⅱatlon)南警：基闲稔法楚臻予小麦最旱爨成功静转捷方法，搬怒蕞静小麦基因工程静主瑟转纯方法，据统计，到现在为{P，在获得的转基因小麦中有90％是用基因枪转化成功的。基潲枪法又称微粒轰击法，它利用火药、高压放电或商愿气体将吸附了外源nNA的金粉或钨粉高迷射入受体细胞而实现外源基因的遗传转化。该法由美翻廉耐尔大学生物化学系John．c．sanford予1984年提出，1987年vlein酋先报道了用基因枪法将TW(烟草花叶痛毒)RNA转入洋葱表皮细胞获得成功，之后这一技

9、零缀嵌被震予小麦等以蘸越其毽方法难皴转纯瓣撼物。1992年，vASlL等人懿廷期墙养弱殛缝愈谯缀缀为乡}援俸，遥过麓辫捻将R一葡萄耱替酶标记基嚣(Gus)及除荤舞《抗经基羁据∞)导入小麦鼎种“Pavon”，从而宣告世界上