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《农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、甘肃农业科技2004年第9期GansuAgr.Sci.andTechn.No.9200411农杆菌介导的烟草高效遗传转化体系研究张宁,王蒂(甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070)摘要:通过对农杆菌介导的烟草遗传转化方法进行优化,建立了一种快速高效的烟草叶盘遗传转化体系。用OD600为0.5的农杆菌悬浮液侵染大小约1cm×1cm烟草叶盘6～9min,然后置于以MS为基本培养基附加2.25mg/L62BA和0.3mg/LNAA的分化培养基上,在100mg/L卡那霉素选择压下,2128d可获得抗性不定芽。通过卡那霉
2、素生根筛选和PCR扩增鉴定,其阳性转基因植株频率可达57.1%。关键词:烟草;农杆菌;叶片;遗传转化;PCR鉴定中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:100121463(2004)0920011203随着分子生物学和基因工程的飞速发展,在许养,每30d继代繁殖一次。多未知基因功能的鉴定、基因的各种调控元件如顺1.1.2农杆菌菌株和质粒试验用根癌农杆菌(A2式调控元件、反式作用因子等机理的研究中,烟草往grobacteriumtumefaciens)菌株为LBA4404,含植物表达往被作为转基因的模式受体植物。
3、在植物基因工程载体pBI121,其结构如图1,抗性标记为Km,由载体中,目前研究最清楚、应用最广泛的外源基因转化方上的nptII基因编码。法便是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的遗传转化技术。在已获得的近200种转基因植物中[1]约有80%是由农杆菌介导完成的。近年来,这种纯生物的方法由于具有转化率高,可导入大片段图1表达载体pBI121的T2DNA结构DNA,且导入基因的拷贝数低,表达效果好,仪器和[2]操作技术较简单等优点,引起了人们的极大关注。1.1.3酶和试剂TaqDNA
4、聚合酶购自上海生物该实验旨在建立农杆菌介导的高效快速的烟草遗传工程(Sangon)公司,PCR引物由Sangon公司合成。转化技术体系,为分子生物学和植物基因工程的研利福平(Rif)和卡那霉素(Km)为Sigma公司产品,羧究提供较好的技术基础。苄青霉素(Carb)和其它试剂为国产分析纯。1材料与方法1.2转化方法1.1实验材料烟草转化采用叶盘法[4]。农杆菌活化:随机挑1.1.1植物材料四倍体烟草(Nicotianatabac2取含有质粒pBI121的农杆菌LBA4404的单菌落接um)品系NT12的无菌试管苗
5、,以MS为基本培养种于LB[5]附加50mg/LKm和25mg/LRif的培养[3]基,附加3%蔗糖,pH5.8,于24℃、自然光下培基中,于28℃、240r/min摇床上过夜培养至OD600收稿日期:2004206220基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2001AA241132)作者简介:张宁(19752),女,甘肃榆中人,讲师,博士,主要从事作物生物技术及遗传育种研究。联系电话:(0931)7631387。14(3/10/30)、水源14类型感染中梁17(3/10/30)、在气温14～1
6、6℃、0～5cm地温稳定在16～18℃时2Hy3(4/40/100)、条中31号(4/25/100)、混合菌(3/播种。播种密度330万～375万粒/hm,宜保穗600210/70)均表现感染,为中感品种,但在大田具有成株万～675万穗/hm。应重施基肥,增施磷肥,一般在22耐锈性。基施农家肥30t/hm、过磷酸钙750kg/hm、尿素150224适宜种植地区及栽培技术要点kg/hm的基础上,返青期再追施尿素112.5kg/hm。冬小麦新品系90109(13)212221适宜在甘肃东拔节至抽穗期叶面喷施2～3g/
7、kg的磷酸二氢钾溶部及陕北、宁夏彭阳等地推广种植。液1～2次,在条锈病发生年注意防条锈病,降水多5栽培技术要点的年份注意防倒伏。根据当地气候情况,新品系90109(13)212221宜(本文责编:程亚军)12甘肃农业科技2004年第9期GansuAgr.Sci.andTechn.No.92004为0.5左右;然后于5000r/min离心6min,其沉淀的植株数量又比较少,转化效率不高。当叶盘大小用MS液体培养基重新悬浮备用。为1.0cm×1.0cm时,平均每块叶盘上分化的植株1.2.1烟草叶盘外植体将无菌烟草试管
8、苗植株多达20株,Km抗性生根筛选时,平均每块叶盘可产的叶片剔除叶脉后剪成小方块,其大小分别为1.5生11株抗性芽,阳性率为5510%(表1)。cm×1.5cm、1.0cm×1.0cm和0.5cm×0.5cm三表1不同大小叶盘的转化频率组。1.2.2叶盘外植体预处理经预培养3d和不经平均分化平均阳性阳性植株预培养两种处理,预培养基与共培养基、分化培养基叶盘大小植株数植株数
