“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析_唐锐敏

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第57卷第1期广东蚕业Vol.57,No.012023年1月GUANGDONGCANYEJan.2023DOI：10.3969/j.issn.2095-1205.2023.01.12“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析唐锐敏石源睿徐子舟贾小云（山西农业大学生命科学学院山西晋中030801）摘要作为我国的一种重要粮食作物，甘薯在抵抗饥荒、保障粮食安全方面发挥着重要作用。近年来，对甘薯的营养和保健功效的研究越来越多，许多以甘薯为原料的新型食品被开发出来。β-胡萝卜素是甘薯中一种重要的生物活性物质，能够转化为维生素A，维持人类眼睛和皮肤的健康，从而改善夜盲症、皮肤粗糙的状况。番茄红素β-环化酶（LCYb）是参与β-胡萝卜素合成的关键酶。本研究从橘肉甘薯品种“普薯32号”中分离得到IbLCYb基因，并对其进行序列分析和编码蛋白的理化性质分析等。结果表明：IbLCYb基因的开放阅读框长度为1506bp，编码501个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为56.45kDa，理论等电点为8.02，属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化分析结果表明：甘薯LCYb与三裂叶薯LCYb的亲缘关系最近。这些结果为进一步研究甘薯LCYb的功能以及调控β-胡萝卜素合成的机制提供理论基础。关键词甘薯；LCYb基因；基因克隆；β-胡萝卜素；序列分析中图分类号:S531文献标识码:A文章编号:2095-1205(2023)01-37-06甘薯（Ipomoeabatatas(L.)Lam.）是世界主要的烯基二磷酸（DMAPP）经过一系列的氧化还原反应[16]粮食作物之一，其在亚洲的种植面积居世界首位，非合成β-胡萝卜素，其中番茄红素环化酶（LCY）[1]洲次之。根据成熟期薯肉颜色的不同，可将其分为调控红色的番茄红素转变为橙色的β-胡萝卜素。研[2]白心甘薯、黄心甘薯、橙心甘薯和紫心甘薯等。彩究表明，番茄红素与β-胡萝卜素在植物体内所占比色甘薯块根因富含类胡萝卜素和花青素等次生代谢例的不同导致植物体所呈现的颜色有所不同，当植物，具有预防心血管疾病、抗肿瘤、调节免疫活性等物体内番茄红素积累较多，果实大多呈现红色，而[17]功效，对人类健康具有巨大的潜在价值，因此成为开当β-胡萝卜素较多时则呈现出橙色。已报道的[3]发功能食品的理想资源。LCY基因分为LCYb和LCYe，前者的作用是控制番类胡萝卜素是一类重要天然色素的总称，普遍存茄红素转化为β-胡萝卜素，后者则是控制番茄红素[4-5][18-19]在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中。β-胡向α-胡萝卜素转化。张亚卿的研究表明，在红萝卜素作为类胡萝卜素家族中的重要一员，在植物体肉蜜柚果实发育至成熟的整个过程中，LCYb和LCYe[6-8]内具有多种生物学功能。例如，β-胡萝卜素可作为基因的表达量迅速降低，抑制番茄红素转化为类胡光合色素参与光合作用；能够防止植物因光氧化而受萝卜素，使得红肉蜜柚汁胞积累大量的番茄红素，[9-10][20]到损害；能使花瓣和果实颜色鲜艳，从而吸引昆果实呈现红色。在烟草中过表达LCYb基因会影响[11]虫等动物授粉、传播种子；还参与植物响应非生物烟草的类胡萝卜素组分比例，同时对烤后烟叶的香[12-13][21]胁迫的途径。对人类而言，β-胡萝卜素在抗氧气物质含量也有所影响。化、解毒、预防心血管疾病、保护肝脏等方面具有重本研究从橙心甘薯“普薯32号”中克隆得到[14]要的生理作用。同时，β-胡萝卜素也是维生素A的IbLCYb，利用生物信息学技术对其及其编码的蛋白质前体，可以预防夜盲症和视力丧失，有助于维持免疫序列进行分析。研究结果为分析IbLCYb在β-胡萝卜[15]系统的正常功能。素合成途径中的调控作用提供一定的参考，为后续甘在植物体内，β-胡萝卜素的合成过程中需要多薯品种的创新及品质的提高奠定研究基础。种关键酶的参与。异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙基金项目：国家青年科学基金项目（31900450）；山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ28）；山西省回国留学人员科研资助项目（2022-094）作者简介：唐锐敏（1990—），女，汉族，山西长治人，博士研究生，副教授，研究方向为薯类作物次生代谢机制。·37·

1第1期“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析第57卷1材料与方法列克隆引物，IbLCYb-F为ATGGATACTTTGCTAAAG，IbLCYb-R为TTAATCTATATCCTGTAAC。以反转录得1.1植物材料、菌株及载体到的甘薯cDNA为模板，对IbLCYb基因进行克隆。试验所选甘薯品种为“普薯32号”（Pushu-32），反应程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，由江苏省农业科学院徐州甘薯研究中心提供，于山西农43.6℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，业大学生命科学学院甘薯试验基地种植。转化所用菌株72℃终延伸2min。扩增产物通过凝胶回收试剂盒为大肠杆菌DH5α，由山西农业大学生命科学学院分子（AxygenScientificInc.,Unioncity,USA）将目的片段生物学实验室保存。克隆载体为PMD19-TVector。回收，并与PMD19-T相连，获得重组质粒PMD19-试验所用PrimeScripTMRTreagentKit反转录试T-IbLCYb。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，并将剂盒、MarkerDL系列，购自TaKara公司；PCR纯化其涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上进行过回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购于AxyPrep公夜培养15h～17h。挑取单克隆进行菌落PCR，将阳司；RNA提取试剂盒购于北京华越洋公司；PCRMix性克隆所提取的质粒送至上海生工生物公司进行测聚合物购自迈维生物。序，阳性克隆的菌液和所提质粒冻于-80℃保存。1.2RNA的提取和cDNA的合成1.4甘薯IbLCYb基因的生物信息学分析取种植90d的甘薯块根0.1g，用液氮快速冷冻并生物信息学分析软件如表1所示，对IbLCYb编码进行研磨。每个样品做3个生物学重复。使用RNA提蛋白的亲疏水性、理化性质、跨膜结构、信号肽、二取试剂盒对甘薯块根的总RNA进行提取，后使用琼脂级结构、三级结构进行预测分析。利用甘薯IbLCYb糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性和质量，并根据编码的蛋白序列，通过BLASTp在NCBI数据库中搜TaKara反转录试剂盒说明书对所提RNA进行反转录。索其他植物LCYb的蛋白序列，使用MEGA7.0软件，1.3IbLCYb基因克隆构建Neiber-Joing（NJ）系统发育树，Bootstrap分析根据NCBI官网上查到的甘薯IbLCYb基因预测序重复数为1000。表1生物信息学所用分析软件软件名称作用网址ProtParam理化性质分析https://web.expasy.org/protparam/ProtScale亲疏水性分析https://web.expasy.org/protscale/TMHMMServerv.2.0跨膜结构螺旋分析https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0NPSA-PRAB蛋白二级结构预测http://npsa-pbil.ibcp.frSWISS-MODEL蛋白三级结构预测https://www.swissmodel.expasy.org/2结果与分析薯IbLCYb预测序列相比，相似度达99.67%（见图2），说明通过试验所得到的结果的确是甘薯IbLCYb2.1橘肉甘薯“普薯32号”块根RNA的提取及基因的序列。IbLCYb基因克隆利用RNA提取试剂盒提取“普薯32号”块根的总RNA，其琼脂糖凝胶电泳结果呈现出3条带，分别是5s、18s和28s（见图1A）。以IbLCYb-F/R为克隆引物，“普薯32号”的cDNA为模板对甘薯IbLCYb进行基因克隆。经琼脂糖凝胶电泳检测，得到了一条长度为1506bp的特异性条带，为IbLCYb（见图1B）。将目的片段割胶回收，连接PMD19-T载体，转化大肠杆菌后进行菌落PCR，目的片段大小与cDNA长度相一致。对含有目图1“普薯32号”块根RNA琼脂糖凝胶电泳的片段的阳性克隆进行扩繁，提取阳性克隆的质粒寄（A）及IbLCYb的扩增产物条带（B）送至生物公司进行测序，测序结果与NCBI网站上甘·38·

2第1期“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析第57卷IbLCYb1ATGGATACTTTGCTAAAGACCCCTAATGAGCTTGAATTTCTGCACCCACATCATGGGTTTGCAGTTAAAGCTAGTGCCTTTACCTCCCTG90IbLCYb1GCGTATGGCATTCTGGCTGAAGTGGAGGAACACCCTTACGATTTGAATAAGATGGTTTTCATGGATTGGCGAGACTCTCACCTAAACAGT810IbLCYb2ATGGATACTTTGCTAAAGACCCCTAATGAGCTTGAATTTCTGCACCCACACCATGGGTTTGCAGTTAAAGCTAGTGCCTTTACCTCCCTG90IbLCYb2GCGTATGGCATTCTGGCTGAAGTGGAGGAACACCCTTACGATTTGAATAAGATGGTTTTCATGGATTGGCGAGACTCTCACCTAAACAGT810IbLCYb_in_NCBIATGGATACTTTGCTAAAGACCCCTAATGAGCTTGAATTTCTGCACCCACATCATGGGTTTGCAGTTAAAGCTAGTGCCTTTACCTCCCTG90IbLCYb_in_NCBIGCTTATGGCATTCTGGCAGAAGTGGAGGAACACCCTTACGATTTGAATAAGATGGTTTTCATGGATNGGCGAGACTCTCACCTAAACAGT810ConsensusgctatggcattctggcgaagtggaggaacacccttacgatttgaataagatggttttcatggatggcgagactctcacctaaacagtConsensusatggatactttgctaaagacccctaatgagcttgaatttctgcacccacacatgggtttgcagttaaagctagtgcctttacctccctgIbLCYb1AACTTGGAGCTAAAGGAGAGAAATAAAAGAATCCCGACCTTTCTTTACGCCATGCCATTTTCCTCGCAGAGGATATTCCTTGAAGAAACC900IbLCYb1AAGCCTCAAAAACAGGAAATTAGGATTGGTTCATGGAAACCTTGCAGGAATGTTGGCCGTGTTAAGGCCAGCAGTAGTGCCCTATTAGAG180IbLCYb2AACTTGGAGCTAAAGGAGAGAAATAAAAGAATCCCGACCTTTCTTTACGCCATGCCATTTTCCTCGCAGAGGATATTCCTTGAAGAAACC900IbLCYb2AAGCCTCAAAAACAGGAAATTAGGATTGGTTCATGGAAACCTTGCAGGAATGTTGGCCGTGTTAAGGCCAGCAGTAGTGCCCTATTAGAG180IbLCYb_in_NCBIAACTTGGAGCTAAAGGAGAGAAATAAAAGAATCCCGACCTTTCTTTACGCCATGCCATTTTTCTCGCAGAGGATATTCCTTGAAGAAACC900IbLCYb_in_NCBIAAGCCTCAAAAACAGGAAATTAGGATTGGTTCATGGAAACCTTGCAGGAATGTTGGCCGTGTTAAGGCCAGCAGTAGTGCCCTATTAGAG180ConsensusaacttggagctaaaggagagaaataaaagaatcccgacctttctttacgccatgccattttctcgcagaggatattccttgaagaaaccConsensusaagcctcaaaaacaggaaattaggattggttcatggaaaccttgcaggaatgttggccgtgttaaggccagcagtagtgccctattagagIbLCYb1TCACTAGTGGCTCGTCCCGGCTTAGATATGAAGGATATTCAGGAAAGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCACTTAGGTATCAACGTCAAGAGC990IbLCYb2TCACTAGTGGCTCGTCCCGGCTTAGATATGAAGGATATTCAGGAAAGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCACTTAGGTATCAACGTCAAGAGC990IbLCYb1CTTGTGCCTGTGACCAAGAAAGAGAATCTTGATTTTGAGCTCCCTATGTTTGAACCCTCTAAAGGGATTGTTGTGGATTTAGCTGTGGTT270IbLCYb_in_NCBITCACTAGTGGCTCGTCCCGGCTTAGATATGAAGGATATTCAGGAAAGAATGGTGGCTCGTTTAAGGCACTTAGGTATCAACGTCAAGAGC990IbLCYb2CTTGTGCCTGTGACCAAGAAAGAGAATCTTGATTTTGAGCTCCCTATGTTTGAACCCTCTAAAGGGATTGTTGTGGATTTAGCTGTGGTT270ConsensustcactagtggctcgtcccggcttagatatgaaggatattcaggaaagaatggtggctcgtttaaggcacttaggtatcaacgtcaagagcIbLCYb_in_NCBICTTGTGCCTGTGACCAAGAAAGAGAATCTTGATTTTGAGCTCCCTATGTTTGAACCCTCTAAAGGGATTGTTGTGGATTTAGCTGTGGTT270ConsensuscttgtgcctgtgaccaagaaagagaatcttgattttgagctccctatgtttgaaccctctaaagggattgttgtggatttagctgtggttIbLCYb1ATTGAAGAAGACGAGCGTTGTGTTATCCCAATGGGAGGTCCCCTACCCGTGATACCCCAACGAGTTGTTGGAATTGGCGGTACTGCAGGT1080IbLCYb2ATTGAAGAAGACGAGCGTTGTGTTATCCCAATGGGAGGTCCCCTACCCGTGATACCCCAACGAGTTGTTGGAATTGGCGGTACTGCAGGT1080IbLCYb1GGGGGTGGCCCTGCTGGGCTTGCAGTGGCACAGCAGGTTTCACAAGCTGGGTTATCAGTTTGTTCAATTGACCCCTCTCCCAAATTGATT360IbLCYb_in_NCBIATTGAAGAAGACGAGCGTTGTGTTATCCCAATGGGAGGTCCCCTACCCGTGATACCCCAACGAGTTGTTGGAATTGGCGGTACTGCAGGT1080IbLCYb2GGTGGTGGCCCTGCTGGGCTTGCAGTGGCACAGCAGGTTTCACAAGCTGGGTTATCAGTTTGTTCAATTGACCCCTCTCCCAAATTGATT360ConsensusattgaagaagacgagcgttgtgttatcccaatgggaggtcccctacccgtgataccccaacgagttgttggaattggcggtactgcaggtIbLCYb_in_NCBIGGGGGTGGCCCTGCTGGGCTTGCAGTGGCACAGCAGGTTTCACAAGCTGGGTTATCAGTTTGTTCAATTGACCCCTCTCCCAAATTGATT360IbLCYb1ATGGTTCATCCCTCGACCGGATATATGGTGGCGAGGACTCTGGCTGCAGCTCCGGTTGTTGCCAACGCAATCATTCAGTACCTAGGTTCC1170ConsensusggggtggccctgctgggcttgcagtggcacagcaggtttcacaagctgggttatcagtttgttcaattgacccctctcccaaattgattIbLCYb2ATGGTTCATCCCTCGACCGGATATATGGTGGCGAGGACTCTGGCTGCAGCTCCGGTTGTTGCCAACGCAATCATTCAGTACCTAGGTTCC1170IbLCYb_in_NCBIATGGTTCATCCCTCGACCGGATATATGGTGGCGAGGACTCTGGCTGCAGCTCCGGTTGTTGCCAACGCAATCATTCAGTACCTAGGTTCC1170IbLCYb1TGGCCCAATAATTATGGAGTTTGGGTGGATGAATTCGAGGCCATGGATTTGTTGGATTGCCTCGATACCACGTGGTCTGGAGCTATGGTG450ConsensusatggttcatccctcgaccggatatatggtggcgaggactctggctgcagctccggttgttgccaacgcaatcattcagtacctaggttccIbLCYb2TGGCCCAATAATTATGGAGTTTGGGTGGATGAATTTGAGGCCATGGATTTGTTGGATTGCCTCGATACCACGTGGTCTGGAGCTATGGTG450IbLCYb_in_NCBITGGCCCAATAATTATGGAGTTTGGGTGGATGAATTCGAGGCCATGGATTTGTTGGATTGCCTCGATACCACGTGGTCTGGAGCTATGGTG450IbLCYb1GAGAGAAGCCTTCTGGGCAACGAATTATCAGCATCTGTTTGGAAAGACCTGTGGCCAATAGAGAGGAGGCGGCAAAGGGAATTCTTTTGT1260ConsensustggcccaataattatggagtttgggtggatgaattgaggccatggatttgttggattgcctcgataccacgtggtctggagctatggtgIbLCYb2GAGAGAAGCCTTCTGGGCAACGAATTATCAGCATCTGTTTGGAAAGACCTGTGGCCAATAGAGAGGAGGCGGCAAAGGGAATTCTTTTGT1260IbLCYb_in_NCBIGAGAGAAGCCTTCTGGGCAACGAATTATCAGCATCTGTTTGGAAAGACCTGTGGCCAATAGAGAGGAGGCGGCAAAGGGAATTCTTTTGT1260ConsensusgagagaagccttctgggcaacgaattatcagcatctgtttggaaagacctgtggccaatagagaggaggcggcaaagggaattcttttgtIbLCYb1TATATTGATGACCGCACGACTAAAGATCTTGACAGGCCTTATGGGCGGGTTAACAGGAAGAAACTCAAATCGAAAATGATGCAGAAATGC540IbLCYb2TATATTGATGACCGCACGACTAAAGATCTTGACAGGCCTTATGGGCGGGTTAACAGGAAGAAACTCAAATCGAAAATGATGCAGAAATGC540IbLCYb1TTTGGTATGGATATTCTACTGAAGCTCGATTTGCCAGCCACAAGAAGATTTTTTGATGCGTTTTTTGATCTAGAACCCCGTTATTGGCAT1350IbLCYb_in_NCBITATATTGATGACCGCACGACTAAAGATCTTGACAGGCCTTATGGGCGGGTTAACAGGAAGAAACTCAAATCGAAAATGATGCAGAAATGC540IbLCYb2TTTGGTATGGATATTCTACTGAAGCTCGATTTGCCAGCCACAAGAAGATTTTTTGATGCGTTTTTTGATCTAGAACCCCGTTATTGGCAT1350ConsensustatattgatgaccgcacgactaaagatcttgacaggccttatgggcgggttaacaggaagaaactcaaatcgaaaatgatgcagaaatgcIbLCYb_in_NCBITTTGGTATGGATATTCTACTGAAGCTCGATTTGCCAGCCACAAGAAGATTTTTTGATGCGTTTTTTGATCTAGAACCCCGTTATTGGCAT1350ConsensustttggtatggatattctactgaagctcgatttgccagccacaagaagattttttgatgcgttttttgatctagaaccccgttattggcatIbLCYb1ATTGCGAATGGTGTTAAGTTTCATCAAGCCAAGGTTATAAAGGTGATCCATGAAGAATCGAAATCCATGTTGATTTGCAGTGATGGTGTG630IbLCYb2ATTGCGAATGGCGTTAAGTTTCATCAAGCCAAGGTTATAAAGGTGATCCATGAAGAATCGAAATCCATGTTGATTTGCAGTGACGGTGTG630IbLCYb1GGATTTCTATCGTCCCGGCTGTTTCTTCGTGAGCTCATATTTTTTGGTCTCTCGCTTTTCTCTCATGCCAGTAATACTTCTAGGTTAGAG1440IbLCYb_in_NCBIATTGCGAATGGTGTTAAGTTTCATCAAGCCAAGGTTATAAAGGTGATCCATGAAGAATCGAAATCCATGTTGATTTGCAGTGACGGTGTG630IbLCYb2GGATTTCTATCGTCCCGGCTGTTTCTTCGTGAGCTCATATTTTTTGGTCTCTCGCTTTTCTCTCATGCCAGTAATACTTCTAGGTTAGAG1440IbLCYb_in_NCBIGGATTTCTATCATCCCGTCTGTTTCTTCGTGAGCTCATATTTTTTGGTCTCTCGCTTTTCTCTCATGCCAGTAATACTTCTAGGTTAGAG1440ConsensusattgcgaatgggttaagtttcatcaagccaaggttataaaggtgatccatgaagaatcgaaatccatgttgatttgcagtgaggtgtgConsensusggatttctatctcccgctgtttcttcgtgagctcatattttttggtctctcgcttttctctcatgccagtaatacttctaggttagagIbLCYb1ACGATTCAAGCAACTGTGGTTCTTGATGCAACTGGCTTTTCTAGATGCCTGGTTCAGTACGATAAGCCTTATAATCCGGGCTATCAAGTT720IbLCYb1ATAATGACCAAGGGCACTTTGCCTCTGGTAAACATGATCAACAATTTGTTACAGGATATAGATTA1505IbLCYb2ACTATTCAAGCAACTGTGGTTCTCGATGCAACTGGCTTTTCTAGATGCCTGGTTCAGTACGATAAGCCTTATAATCCGGGCTATCAAGTT720IbLCYb2ATAATGACCAAGGGCACTTTGCCTCTGGTAAACATGATCAACAATTTGTTACAGGATATAGATTA1505IbLCYb_in_NCBIACGATTCAAGCAACTGTGGTTCTTGATGCAACCGGCTTTTCTAGATGCCTGGTTCAGTACGATAAGCCTTATAACCCGGGCTATCAAGTT720IbLCYb_in_NCBIATAATGACCAAGGGCACTTTGCCTCTGGTAAACATGATCAACAATTTGTTACAGGATATAGATTA1505ConsensusacattcaagcaactgtggttctgatgcaacggcttttctagatgcctggttcagtacgataagccttataaccgggctatcaagttConsensusataatgaccaagggcactttgcctctggtaaacatgatcaacaatttgttacaggatatagatta图2IbLCYb测序结果与NCBI网站预测序列比对2.2甘薯IbLCYb蛋白的理化性质分析8.02。用ProtScale和TMHMMServerv.2.0工具在线对IbLCYb蛋白的理化性质进行分析，结果显示分析该蛋白序列，可判断IbLCYb蛋白是一个无跨膜IbLCYb基因编码501个氨基酸（见图3A），IbLCYb结构域的亲水不稳定蛋白（见图3B和图3C）。蛋白的相对分子质量为56.45kDa，理论等电点为图3IbLCYb蛋白的氨基酸序列（A）、疏水性分析（B）及跨膜域分析（C）2.3甘薯IbLCYb蛋白结构分析之，为16.17%，β转角最少，为4.99%（见图4A）。IbLCYb蛋白的二级结构由α螺旋、β片层、β转其三级结构也表明，IbLCYb蛋白中无规卷曲和α螺角及无规卷曲构成，其中占比最多的是无规卷曲和α旋最多（见图4B）。螺旋，所占比例分别为41.52%和37.3%，β片层次图4IbLCYb蛋白序列二级结构及三级结构预测分析·39·

3第1期“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析第57卷2.4甘薯IbLCYb酶切位点分析切位点，如BsaⅠ、SpeⅠ等（见图5）。该结果可为后用NEBcutterV2.0在线工具对IbLCYb基因序列进期构建过表达载体提供依据。行酶切位点的预测，结果显示IbLCYb基因有多个酶图5甘薯IbLCYb酶切位点预测2.5甘薯IbLCYb的系统进化分析trifida）、胡萝卜（Daucuscarotasubsp.）、甜椒在NCBI网站对甘薯（Ipomoeabatatas）IbLCYb（Capsicumannuum）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）蛋白序列进行BLASTp比对，挑选出9条IbLCYb的和欧洲油菜（Brassicanapus），用MEGA7.0软件对上同源序列，分别来自烟草（Nicotianatabacum）、番茄述10条序列进行进化树分析，其中甘薯与三浅裂野牵（Solanumlycopersicum）、马铃薯（Solanumtuberosum）、牛LCYb序列同源关系最近（见图6）。裂叶牵牛（Ipomoeanil）、三浅裂野牵牛（Ipomoea图610个物种LCYb的系统发育树3讨论与结论力，因此能很好地清除氧自由基和降低脂质氧化物含[22]量，并明显改善机体的氧化状态。甘薯作为我国的一种重要粮食作物，在保障粮食番茄红素环化酶（LYCb）作为β-胡萝卜素合成安全方面发挥着重要作用。甘薯块根及茎叶中均含有途径中的关键酶，其表达量的高低决定了植物组织多种生物活性物质，其中β-胡萝卜素就是重要的活性的颜色。前人对柑橘、番茄、金盏菊、黄花龙胆等物质之一，其多烯烃结构具有较强的自由基捕捉能·40·

4第1期“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析第57卷植物的研究表明，LCYb基因的表达与花和果实中类al.Carotenoidcleavageoxygenasesfrommicrobesand[23]胡萝卜素含量呈正相关。在橙色甜瓜中发现，photosyntheticorganisms:featuresandfunctions[J].Int-LYCb基因表达量越高，其果实中β-胡萝卜素的含量ernationalJournalofMolecularSciences,2016,17(11):[24]越高。王曼曼等的研究表明，在番茄果实着色1781.期，温度变化能够抑制LCYb基因表达从而影响β-胡[10]曲蕙名,王莹,楚杰,等.β-胡萝卜素抗氧化作用的研[25]萝卜素的积累。强光显著诱导小麦LCYb基因的表究[J].饲料工业,2018,39(2):9-14.达，其体内的β-胡萝卜素含量变化与LCYb基因表达[11]刘冬松,邵剑钢,韩培涛,等.β-胡萝卜素在高原功能[26]量的变化相对应。食品中的应用[J].食品研究与开发,2015,36(13):147-149.“普薯32号”又名西瓜红，是普宁市农业科学研[12]KIMSH,AHNYO,AHNMJ,etal.Down-regu-lation究所选育的甘薯新品种，该品种薯块呈红皮橙心，富ofβ-carotenehydroxylaseincreasesβ-caroteneandtotal[27]含胡萝卜素，营养价值和保健功能较高。本研究从carotenoidsenhancingsaltstresstoleranceintransgenic“普薯32号”中成功克隆到甘薯的IbLYCb基因，其片culturedcellsofsweetpotato[J].Phytoch-emistry,2012,74:段大小为1506bp，编码501个氨基酸。利用生物信69-78.息学软件对IbLYCb蛋白进行理化性质和结构分析，[13]KIMSH,JEONGJC,PARKS,etal.Down-regula-tion发现其为无跨膜结构域的亲水性蛋白，这可能与其在ofsweetpotatolycopeneβ-cyclasegeneenhancestolerance植物体内发挥的功能相适应。在NCBI上搜索不同物toabioticstressintransgeniccalli[J].MolecularBiology种的LYCb序列并构建发育进化树，结果显示甘薯的Reports,2014,41:8137-8148.LYCb的氨基酸序列与其近缘野生种三浅裂野牵牛的[14]COLLINSAR.OxidativeDNAdamage,antioxida-nts,LYCb亲缘关系最近，表明甘薯的LYCb可能与三浅裂andcancer[J].BioEssays,1999,21(3):238-246.野牵牛的LYCb具有相似的功能和作用机制。这些结[15]YEX,AL-BABILIS,KLÖTIA,etal.Engineeringthe果为进一步研究IbLYCb的功能以及β-胡萝卜素的合provitaminA(beta-carotene)biosyntheticpathwayinto成机制提供理论基础。(carotenoid-free)riceendosperm[J].Science,2000,287(5451):303-305.参考文献[16]王紫璇,李佳佳,于旭东,等.高等植物类胡萝卜素生物[1]马代夫.我国甘薯产业发展若干问题的思考[J].农业合成研究进展[J].分子植物育种,2021,19(8):2627-2637.工程技术(农产品加工业),2013(11):21-24.[17]SKELTONRL,YUQY,SRINIVASANR,etal.[2]马琴燕.浅谈宁洱镇黄心甘薯产业发展前景及对策Tissuedifferentialexpressionoflycopenebeta-cyclase[J].农业开发与装备,2014(8):12.geneinpapaya[J].CellResearch,2006,16(8):731-739.[3]肖利贞,王裕欣.名优鲜食彩色甘薯品种推介[J].乡村[18]PANDURANGAIAHS,RAVISHANKARKV,科技,2015(23):11.SHIVASHANKARKS,etal.Differentialexpressionof[4]AHRAZEMO,DIRETTOG,ARGANDONAJ,etcarotenoidbiosyntheticpathwaygenesintwocontr-astingal.Evolutionarilydistinctcarotenoidcleavagedioxygenasestomatogenotypesforlycopenecontent[J].JournalofBiosc-areresponsibleforcrocetinproductioninBuddlejaiences,2016,41(2):257-264.davidii[J].JournalofExperimentalBotany,2017,68(16):[19]RONENG,CARMEL-GORENL,ZAMIRD,etal.An4663-4677.alternativepathwaytobeta-caroteneformationinplant[5]余凡,赵少丹,葛亚龙,等.β-胡萝卜素的提取合成分离chromoplastsdiscoveredbymap-basedcloningofbeta及在饲料行业的应用[J].饲料研究,2014(7):34-39.andold-goldcolormutationsintomato[J].Proceedings[6]王典,杨帆,李国栋.β-胡萝卜素功能及其在奶牛上的oftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStates应用进展[J].中国奶牛,2022(3):16-20.ofAmerica,2000,97(20):11102-11107.[7]盛保伟,杨一恭.天然β-胡萝卜素发酵法研究进展[J].[20]张亚卿.琯溪蜜柚色泽突变体类胡萝卜素代谢特征生物技术世界,2014(9):62.分析[D].武汉:华中农业大学,2013.[8]李建喜,方泽华.β-胡萝卜素的合成路线研究进展[J].[21]杨永霞,张嘉炜,张洪映,等.过表达Lcy-b基因对烟广东化工,2017,44(9):176-177.草类胡萝卜素代谢及香气物质的影响[J].中国烟草学[9]AHRAZEMO,GOMEZ-GOMEZL,RODRIGOMJ,et报,2016,22(3):94-100.·41·

5第1期“普薯32号”中LCYb基因的克隆与序列分析第57卷[22]杨德孟.β-胡萝卜素对紫苏油抗氧化活性及其稳定种,2020,18(18):6158-6164.性研究[D].宁波:宁波大学,2020.[26]ZENGJ,WANGC,CHENX,etal.Thelycopeneβ-[23]李晶,窦润秋,周栋,等.不同果肉颜色蜜柚番茄红素cyclaseplaysasignificantroleinprovitaminAbiosynth-环化酶基因的表达分析[J].东南园艺,2018,6(1):13-16.esisinwheatendosperm[J].BMCPlantBiology,2015,15[24]赵军林,于喜艳,王秀峰.橙色果肉甜瓜β-胡萝卜素(1):112.积累的分子机理[J].山东农业科学,2014,46(5):7-11,30.[27]黄景煌.“普薯32号”特征特性及高产栽培技术[J].[25]王曼曼,薛舒丹,吴廷全,等.光照和温度调控对番茄福建热作科技,2022,47(3):61-62,66.果实中类胡萝卜素合成的影响[J].分子植物育（上接第36页）被覆盖时空变化与驱动力分析[J].中国生态农业学报4结论(中英文),2022,30(11):1737-1749.本研究基于GEE云平台，在MODISEVI数据集[4]谷雷,岳彩荣,赵勋,等.基于GoogleEarthEngine的云的基础上，利用像元二分法模型估算了2000年—2020南省1999—2018年植被覆盖度变化分析[J].西部林业年珠江流域的植被覆盖度，并采用一元线性回归和空科学,2020,49(5):74-80.间转移矩阵的方法探讨近21年来珠江流域植被覆盖度[5]廖成浩,曾艳,姚昆,等.江西植被EVI时空动态监测及时空变化特征，得出以下结论：驱动因素分析[J].云南大学学报(自然科学版),2022,44（1）在时间上，2000年—2020年珠江流域的植被(5):981-989.覆盖度总体上呈现上升趋势，植被覆盖率较高，处于[6]伍宜丹,马悦,吴浩然,等.基于MODIS-EVI指数的四0.529～0.589之间。川省植被指数时空演变特征及驱动力[J].水土保持研（2）在空间上，珠江流域植被覆盖度空间上明显究,2020,27(5):230-236,243,2.呈西高东低的分布格局，植被覆盖度呈改善趋势的区[7]王行汉,丛沛桐,刘超群,等.2004—2013年珠江流域植被域面积大于呈退化趋势的区域面积。此外，研究区内变化及其胁迫分析[J].生态学报,2017,37(19):6494-6503.实施生态修复工程后，大部分植被低覆盖度区域改善[8]王睿卿,蒋晓辉,聂桐.基于地理探测器的珠江流域NDV变为植被中覆盖度区域。I时空变化及驱动力分析[J].人民珠江,2022,43(7):61-73.本文从时间和空间两个角度分析珠江流域近21年[9]吴志勇,白博宇,何海,等.珠江流域1981—2020年水来的植被覆盖变化情况，在今后的研究中，将进一步文干旱时空特征分析[J/OL].河海大学学报(自然科学考虑自然因素和人为因素对植被覆盖变化的影响，从版):1-10[2022-08-12].http://kns.cnki.net/kcms/detail/而为珠江流域植被恢复及生态环境建设提出更加合理32.1117.TV.20220812.1155.002.html.的治理和保护方案。[10]冯李.金沙江流域植被覆盖度的遥感动态监测及其驱动机制研究[D].昆明:云南师范大学,2021.参考文献[11]朱林富,谢世友,杨华,等.基于MODIS-EVI的四川[1]陈宽,杨晨晨,白力嘎,等.基于地理探测器的内蒙古植被覆盖地形分布特征[J].西南大学学报(自然科学自然和人为因素对植被NDVI变化的影响[J].生态学版),2022,44(9):122-132.报,2021,41(12):4963-4975.[12]李亚楠.新疆2001-2020年NDVI时空特征及其对[2]邓元杰,姚顺波,侯孟阳,等.长江流域中上游植被环境因子响应研究[D].乌鲁木齐:新疆大学,2021.NDVI时空变化及其地形分异效应[J].长江流域资源与[13]李美丽,尹礼昌,张园,等.基于MODIS-EVI的西南环境,2020,29(1):66-78.地区植被覆盖时空变化及驱动因素研究[J].生态学[3]丁永康,叶婷,陈康.基于地理探测器的滹沱河流域植报,2021,41(3):1138-1147.·42·