通过两种不同载体表达的猪细小病毒VP2生物学特性的比较研究

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Universitycode：10223Classifiedcode：S855.3Graduatenumber：S2011092Confidentialdegree：publicHeilongjiangBayiAgriculturalUniversityMasterDissertationComparativeStudyonBiologicalPropertiesofPorcineParvovirusVP2expressedbytwodifferentvectorsPostgraduate：CuiYuchaoSupervisor：CuiShangjinMajor：VeterinaryPreventionScienceEpidemiologyandmolecularResearchdirection：biologyofswineDegreecategory：MasterofAgronomyDaqingChinaJune,2014 摘要猪细小病毒（Porcineparvovirus,PPV）是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。PPV感染呈世界性分布，在许多地方已经成为地方性疾病，给养猪业造成严重的经济损失。PPV属于细小病毒科细小病毒属，为单股负链DNA病毒，无囊膜，衣壳蛋白包括VP1、VP2和VP3，其中VP2为主要的结构蛋白。VP2决定着PPV的组织嗜性、毒力和血凝活性，并且能够诱导机体产生中和抗体。VP2在杆状病毒表达载体系统（BEVS）中能够自我组装成病毒样颗粒（VLPs），是亚单位疫苗研究的首选蛋白。为评价VP2作为亚单位疫苗的潜力，本研究分别利用BEVS和pET表达系统表达VP2，比较其反应原性和免疫原性的差异。应用电子显微镜观察两种VP2的形态，发现BEVS表达的VP2能够自我组装成VLPs，而pET表达系统表达的VP2不能组装成VLPs。westernblot试验发现这两种VP2均能够与PPV阳性血清发生特异性反应。血凝试验（HA）发现BEVS表达的VP2具有血凝活性，10血凝效价为2，而pET表达系统表达的VP2无血凝活性。将两种VP2作为免疫试剂分别免疫豚鼠，将豚鼠随机分Ⅰ组（灭活疫苗1.5mL/只）、Ⅱ组（灭活疫苗0.5mL/只）、Ⅲ组（VLPs300μg/只）、Ⅳ组（VLPs100μg/只）、Ⅴ组（VP2300μg/只）、Ⅵ组（VP2100μg/只）和Ⅶ组（非免疫）共七组。每周采血应用血凝抑制试验（HI）测定血清中PPV抗体效价。Ⅲ组和Ⅳ组的抗体水平相近，高于Ⅱ组，但是低于Ⅰ组。Ⅴ组和Ⅵ组的抗体水平最低。Ⅰ组、Ⅲ组和Ⅴ组的抗体水平分别高于Ⅱ组、Ⅳ组和Ⅵ组。攻毒后，MTT淋巴细胞增殖试验结果表明，各种免疫试剂均能不同程度地诱导产生细胞免疫应答。纳米PCR检测结果表明仅有对照组豚鼠内脏中检出PPV。可见BEVS表达的VP2反应原性和免疫原性较好，适用于亚单位疫苗的研制。关键词：猪细小病毒VP2杆状病毒表达载体系统pET表达系统生物学特性I AbstractPorcineparvovirus(PPV)isoneofthemainpathogenswhichcancausereproductivefailureinsows.PPVinfectionisdistributedworldwide,andhasbecomeendemicdiseaseinmanyplaces,causessevereeconomiclossestothepigindustry.PPVbelongingtoParvoviridaeparvovirusgenus,isasinglenegativestrandedDNAviruswithoutenvelope.CapsidproteinsincludeVP1,VP2andVP3,ofthethreeproteinsVP2isthemainstructuralproteinanddeterminestissuetropismofthevirus,thevirulenceandhemagglutinationactivityandcanstimulatebodytoproduceneutralizingantibodies.VP2couldself-assembleintoviruslikeparticles(VLPs)inbaculovirusexpressionvectorsystem(BEVS)andisthepreferredproteininsubunitvaccineresearch.Toestimatethepotencyassubunitvaccine,VP2proteinswererespectivelyexpressedusingBEVSandpETexpressionsystemandusedtocomparethereactogenicityandimmunogenicity.ElectronmicroscopywasusedtoobservetwokindsofVP2.VP2expressedinBEVScouldself-assembleintoVLPs,andVP2expressedinpETexpressionsystemcouldnotassembleintoVLPs.WesternblotshowedthatbothofthesetwoproteinswereabletoreacttoPPVpositiveserum.Hemagglutination(HA)showedthatVP2expressedinBEVScouldproducea10hemagglutinationactivitywiththehemagglutinationtiterof2,whileVP2expressedinpETexpressionsystemhadnohemagglutinationactivity.TwokindsofVP2proteinswereusedasimmunoreagentstoimmunizeguineapigs.Guineapigswererandomlydistributedintosevengroups:Ⅰgroup(inactivatedvaccine1.5mL/guineapig),Ⅱgroup(inactivatedvaccine0.5mL/guineapig),Ⅲgroup(VLPs300μg/guineapig),Ⅳgroup(VLPs100μg/guineapig),Ⅴgroup(VP2300μg/guineapig),Ⅵgroup(VP2100μg/guineapig)andⅦgroup(non-immunized).Serumsweretakenonceaweekandtestedbyhemagglutinationinhibition(HI)tomeasurethePPVantibodytiter.TheantibodylevelsofgroupⅢandgroupⅣweresimilar,andhigherthanthatofgroupⅡ,butlowerthanthatofgroupⅠ.TheantibodylevelsofgroupⅤⅥandgroupwerethelowest.GroupⅠ,groupⅢandgroupⅤcouldstimulatebetterhumoralimmuneresponsesthangroupⅡ,groupⅣandgroupⅥ,respectively.Afterchallenge,resultsofMTTlymphocyteproliferationtestshowedthatimmunoreagentsallcouldinducecellularimmuneresponseswithdifferentlevels.ResultsofnanoPCRshowedthatonlytheII guineapigsorgansofnon-immunizedgroupweredetectedtobePPVpositive.Inconclusion,VP2expressedinBEVShadbetterreactogenicityandimmunogenicity,andwasapplicablefordevelopmentofsubunitvaccine.Keywords:porcineparvovirus;VP2;baculovirusexpressionvectorsystem;pETexpressionsystem;biologicalpropertiesIII 目录第一章文献综述...........................................................................................................................11.1PPV研究进展.....................................................................................................................11.1.1PPV简介........................................................................................................................11.1.2PPV感染的临床症状....................................................................................................11.1.3PPV的分子生物学特性................................................................................................11.1.4PPV的培养特性............................................................................................................21.1.5PPV感染机制................................................................................................................21.1.6PPV感染的组织病变....................................................................................................31.1.7PPV的流行病学............................................................................................................31.2VP2基因及其编码的蛋白研究进展...................................................................................41.3PPV疫苗研究进展...............................................................................................................61.3.1弱毒疫苗.......................................................................................................................61.3.2灭活疫苗.......................................................................................................................61.3.3基因疫苗.......................................................................................................................71.4研究的目的及意义..............................................................................................................9第二章VP2在杆状病毒表达载体系统中的表达.....................................................................112.1试验材料与器材................................................................................................................112.1.1试验材料.....................................................................................................................112.1.2主要试验器材.............................................................................................................112.2试验方法............................................................................................................................112.2.1重组杆状病毒在Sf9细胞中的培养.........................................................................112.2.2VP2电镜观察..............................................................................................................122.2.3VP2Westernblot试验................................................................................................122.2.4VP2血凝试验..............................................................................................................122.2.5VP2纯化......................................................................................................................132.3结果....................................................................................................................................132.3.1VP2电镜观察结果......................................................................................................132.3.2VP2Westernblot试验结果........................................................................................14IV 2.3.3VP2血凝试验结果.....................................................................................................142.3.4VP2纯化结果..............................................................................................................152.4讨论....................................................................................................................................16第三章VP2在pET表达系统中的表达....................................................................................173.1试验材料与器材................................................................................................................173.1.1试验材料.....................................................................................................................173.1.2主要试验器材..............................................................................................................173.2试验方法............................................................................................................................183.2.1引物设计.....................................................................................................................183.2.2PPV基因组DNA的提取...........................................................................................183.2.3VP2基因全长序列的扩增..........................................................................................183.2.4PCR产物的纯化.........................................................................................................193.2.5重组质粒的构建.........................................................................................................193.2.6重组质粒的提取.........................................................................................................193.2.7重组质粒的鉴定.........................................................................................................203.2.8重组质粒的表达.........................................................................................................203.2.9VP2电镜观察..............................................................................................................213.2.10VP2Westernblot试验..............................................................................................213.2.11VP2血凝试验............................................................................................................213.2.12VP2纯化....................................................................................................................223.3结果....................................................................................................................................223.3.1VP2基因全长序列的扩增结果..................................................................................223.3.2重组质粒的鉴定结果.................................................................................................233.3.3重组质粒的表达结果.................................................................................................233.3.4VP2电镜观察结果......................................................................................................243.3.5VP2Westernblot试验结果........................................................................................243.3.6VP2血凝试验结果......................................................................................................253.3.7VP2纯化结果..............................................................................................................253.4讨论....................................................................................................................................26第四章纳米PCR检测方法的建立...........................................................................................27V 4.1试验材料............................................................................................................................274.2试验方法............................................................................................................................274.2.1引物设计.....................................................................................................................274.2.2VP2重组质粒模板的制备..........................................................................................274.2.3纳米PCR检测方法的建立以及条件优化...............................................................284.2.4敏感性试验.................................................................................................................284.2.5特异性试验.................................................................................................................284.2.6纳米PCR与普通PCR对临床样品的检测比较......................................................284.3结果....................................................................................................................................284.3.1阳性模板的制备.........................................................................................................284.3.2纳米PCR检测方法的建立以及条件优化...............................................................294.3.3敏感性试验.................................................................................................................294.3.4特异性试验.................................................................................................................304.3.5临床样品的检测.........................................................................................................304.4讨论....................................................................................................................................30第五章VP2亚单位疫苗免疫豚鼠试验.....................................................................................335.1试验材料............................................................................................................................335.2试验方法............................................................................................................................335.2.1豚鼠试验免疫方案.....................................................................................................335.2.2血凝抑制试验.............................................................................................................335.2.3病毒TCID50的测定...................................................................................................345.2.4攻毒以及保护效力的评价.........................................................................................345.2.5淋巴细胞增殖试验.....................................................................................................345.2.6纳米PCR检测...........................................................................................................355.3结果....................................................................................................................................355.3.1血凝抑制试验结果.....................................................................................................355.3.2淋巴细胞增殖试验结果.............................................................................................365.3.3纳米PCR检测结果...................................................................................................375.4讨论....................................................................................................................................385.4.1血凝抑制试验.............................................................................................................38VI 5.4.2淋巴细胞增殖试验.....................................................................................................395.4.3纳米PCR检测...........................................................................................................40第六章结论.............................................................................................................................43参考文献.......................................................................................................................................45附录...........................................................................................................................................55致谢...........................................................................................................................................55作者简历.......................................................................................................................................57VII 第一章文献综述1.1PPV研究进展1.1.1PPV简介猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一，以死[1]胎、木乃伊胎、死产、母猪流产、延期发情和产弱仔为主要特征。易感母猪在配种和妊[2]娠期间感染PPV，病毒可以通过胎盘屏障感染胚胎或者胎儿，在子宫内病毒也可以在胎[3][4-5]儿之间互相感染。PPV在猪体内的主要特点是极度耐受和高度感染。经证实，PPV与[6-7][8]猪消瘦综合征和猪非化脓性心肌炎有关。另外，PPV可以引起仔猪皮炎和腹泻。PPV[9-10]在仔猪断奶多系统衰竭综合征和猪呼吸道综合征中也起到非常重要的作用。PPV是细小病毒家族的成员之一，属于细小病毒科、细小病毒属。同属的其他成员包括阿留申病毒、牛细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒、鹅细小病毒、小鼠细小病毒、大鼠细小病毒、兔细小病毒、貂肠炎病毒、鸡细小病毒、浣熊细小病毒、人细小[11]病毒等。虽然PPV与其他同属病毒有明显不同，但是部分抗原性是相同的。PPV为无囊膜单链DNA病毒，整个基因组大小约为5kb，病毒粒子的衣壳是一个直径为25nm的二十面等轴对称体。衣壳蛋白包括三种蛋白：VP1、VP2和VP3，其中VP2[12][13]为主要的衣壳蛋白，病毒粒子的衣壳主要由50-60个VP2结构蛋白分子构成。1.1.2PPV感染的临床症状母猪在不同妊娠期感染PPV有不同的临床表现。如果PPV感染发生在妊娠35天之前，将会导致部分或者全部胎儿死亡并且被母体重新吸收，进而导致产子数量下降或者母体重新发情。如果PPV感染发生在妊娠35天至70天之间，将会导致一个或者多个胎儿死亡并且木乃伊化。如果PPV感染发生在妊娠70天之后，则母猪主要表现为亚临床症状，胎儿[14]则产生针对PPV的抵抗力，新生仔猪为血清学阳性。公猪或者未怀孕母猪的急性PPV[15]感染一般不表现出临床症状。1.1.3PPV的分子生物学特性PPV基因组含有多于两个开放阅读框架（ORF），靠近5’端的ORF主要编码非结构蛋白NS1、NS2和NS3（推测蛋白），分子量大小分别为75.5kDa、18.1kDa和12.4kDa，非结构蛋白主要参与病毒的复制。靠近3’端的ORF主要编码结构蛋白VP1、VP2和VP3，1 [16-20]分子量大小分别为84kDa、64kDa和60kDa。有研究表明，自主型细小病毒的[21-22]结构蛋白VP3是由细胞蛋白酶切割VP2N端4kDa的甘氨酸富集区产生。非结构基因和结构基因的编码区存在一定程度的重叠。整个基因组含有两个启动子，P4和P40，分别[23]启动表达非结构蛋白和结构蛋白。通过对所有PPV分离株的比较研究发现，所有分离株的抗原性都相似，这说明PPV[24][25]只有一个血清型。不过，有报道表明，不同分离株的毒力存在差异。[26]PPV毒株可依据其致病性的差异而进行分类。第一类毒株，比如NADL-2毒株为非致病性毒株，用于制作弱毒疫苗，此类毒株只引起轻微的病毒血症，通过临床试验证实这[27]种毒株不能通过胎盘屏障感染胎儿。虽然NADL-2毒株经口接种是没有危害的，但是，[28]如果将该毒株直接注射到母猪子宫胚胎外液中就会导致胎儿感染。第二类毒株是从木乃伊胎体内分离的致病性毒株，比如NADL-8毒株和IAF-76毒株，此类毒株可以引起病毒血症并且能够穿过胎盘屏障感染胎儿，这些致病性毒株的感染对于没有免疫力的胎儿是致[29][30]命的。NADL-8毒株的高倍稀释物的感染性和致病性比NADL-2毒株高至少10000倍。[31]第三类毒株，比如Kresse毒株和IAF-A54毒株，此类毒株与皮炎有关，其毒力更强，[25]与其他毒株相比，这类毒株能够直接杀死没有免疫力的胎儿。第四类毒株是从肠道样品[23]中分离的肠道型毒株（IAF-A83），该毒株的基因组已经由PCR扩增获得。1.1.4PPV的培养特性PPV可以通过多种猪体细胞进行体外扩增培养。早期代次的细胞比细胞系对PPV更加易感。胎猪肾细胞一般用于病毒检测和PPV体外扩增。PPV在细胞内通过有丝分裂的方式实现病毒复制，病毒利用细胞内的酶进行DNA复制。PPV在细胞内的复制能够导致细胞死亡，特点为细胞聚集、核固缩和细胞裂解。细胞初次感染大约8h后，可以通过免疫标记技术在感染细胞的细胞核中检测到病毒，病毒不断地聚集在细胞核中直到16h时细胞开始出现细胞病变，最后细胞裂解释放出大团块抗原和病毒，病毒再感染附近的未感染细胞。感染细胞死后失去了病毒复制所需要的条件，但是病毒能够在细胞质中持续存活几天的时[24]间。1.1.5PPV感染机制临床上，PPV感染主要是胎儿的感染，而病毒是如何通过胎盘屏障感染胎儿的呢？一般，病毒从机体的一个部位转移到另一个部位主要通过三种方式：第一种是病毒通过流动的液体比如血液或者淋巴液进行传播，第二种是病毒附着于细胞表面或者藏于细胞内部比2 如通过巨噬细胞的移动进行传播，第三种是病毒通过渐进式复制感染周围细胞而进行传播。母猪和胎儿的循环系统是严格分开的，在子宫内甚至是抗体也不会从母体传递给胎儿。有试验表明，在母猪感染PPV后的不同阶段取出母猪子宫，发现胎盘屏障的各层组织（包括母体的内皮组织、连接组织和子宫上皮组织以及胎儿的滋养外胚层、连接组织和内皮组织）对PPV都不易感。所以，PPV感染胎儿的方式不是第一种方式和第三种方式，PPV可能是通过可移动细胞比如母体的巨噬细胞穿过胎盘屏障进而感染胎儿。这种情况是小概率事件，但是可以解释为什么一窝仔猪中只有一部分感染PPV这种现象。当PPV接触到孕体（胚胎或者胎儿），而此时孕体（胚胎或者胎儿）的各个组织正在经历大规模的有丝分裂，这为病毒的复制分裂提供一个非常有利的环境。有试验表明，在PPV感染后，收集不同时期的胚胎或者胎儿检测其各个组织中的病毒量，发现病毒在胚胎或者胎儿的组织中进行了大量的繁殖。因此，导致孕体死亡的原因为PPV大量聚集在各个[24]组织器官中造成组织器官严重损伤以及病毒对孕体和胎盘的血管系统造成严重的影响。1.1.6PPV感染的组织病变实际上，PPV感染所导致胚胎或者胎儿的病变一般都不可见，因为发生PPV感染时胚胎会被吸收或者胎儿正在木乃伊化。不过，在试验条件下（在感染的不同时期采集胎儿进行观察）可以观察到胚胎或者胎儿的一系列病变：（1）胎儿会发生不同程度的发育不良，有时候甚至停止发育；（2）偶尔可见进行性血管突出，这是由于血管内发生血栓，血液从血管漏到周围的组织中；（3）可观察到充血、水肿和出血，血液血清在体腔内聚集；（4）胎儿的皮肤和其他组织器官发生出血性变色（死后颜色逐渐变深）；（5）胎儿脱水（木乃[32]伊化）。产生抗体存活下来的胎儿（在母猪妊娠70天之后感染的胎儿）其组织会发生[33]适应性与免疫耐受的改变。先天性感染的死产仔猪可能患有脑膜脑炎。1.1.7PPV的流行病学1966年在欧洲，Mayr和Mahnel用猪肾原代细胞进行猪瘟病毒培养时首次分离得到[34]PPV，其病原体被鉴定为DNA病毒。PPV病原性的确定是在1967年。中国首次报道分[35][6，36，37，38]离得到PPV是在1983年。在猪群中PPV感染无处不在，呈世界性分布。在[39]许多地方PPV感染已经成为地方性疾病。典型的循环感染为：仔猪出生时，母猪通常已经接种过疫苗，仔猪通过吸食母乳而获得较高水平的母源抗体。这种被动获得的抗体水平[40-41]在4个月到6个月时会逐渐下降，这段时间仔猪很难被感染。随着被动获得的抗体逐渐衰退，猪体开始被PPV感染并且获得主动免疫产生抗PPV的抗体。由于猪体总能接触3 到抗原，这种主动免疫可以伴随猪的一生，如果母猪在怀孕之前就能够获得这种天然的主动免疫，那么PPV感染导致的繁殖障碍将大大减少。不过，由于各种各样的原因，许多母猪逃过这种天然的感染过程直到它们第一次怀孕，如果母猪在妊娠期的前半段时间接触到[4，32]PPV，病毒就会穿过胎盘屏障造成母猪繁殖障碍。如果母猪在妊娠期的后半段时间感染PPV，会导致平均每窝仔猪感染数量升高。这是因为随着胎儿逐渐长大，母体和胎儿的[24]胎盘之间的接触面积逐渐增大，子宫的血流量也增多。PPV的水平传播一般为易感猪通过直接接触急性感染猪而发生感染，易感猪也可以通过间接采食或者吸入含有病毒的分泌物或者排泄物而感染，没有证据表明带毒猪会长时间向外界排放病毒，主要的传染源更可能是被污染的环境。将易感猪放入曾经住过急性感染猪的房间里，结果显示PPV在宿主体外能保持其感染性至少4个月，相反地，将同一只急性感染猪和其他易感猪放入一个单独[42]的隔离的房间里，这只急性感染猪只向外排毒几个星期。成年公猪基本上不表现出临床症状，急性感染后，可在长达7周的时间内从公猪的阴囊淋巴结和精液中分离得到PPV。[24]公猪可作为没有任何感染症状的病毒携带者感染母猪。1.2VP2基因及其编码的蛋白研究进展1996年，Bergeron等研究将Kresse毒株和NADL-2毒株的基因组进行比对，发现它们的非编码区基本上都一致，编码区中编码非结构蛋白的基因有四个区域是不同的，但是这四个区域都是沉默的，编码区中编码结构蛋白的基因有八个区域是不同的，其中有六个区域的编码序列发生了改变，有一个区域在VP1特有部分的序列上，其余的都在VP2序列上。将临床病料（木乃伊胎和甲状腺细胞）中分离得到的强毒株（比如IAF-22分离株）的序列与NADL-2毒株的序列相对比，发现同样为这六个区域不同。构建六个区域突变毒株，将这些毒株分别接种于不同细胞后发现，在VP1/VP2编码区域中的这几个突变决定了毒株的嗜性，即结构蛋白决定PPV的嗜性，在病毒与细胞相互结合和作用的过程中起到重要作[23]用。NADL-2毒株右侧开放阅读框架处含有一个127bp重复序列，而Kresse毒株则不含有这个重复序列。临床病料中分离得到IAF-3毒株的氨基酸序列和NADL-2毒株一样，但是基因组中不含有127bp重复序列。通过接种细胞发现127bp重复序列与病毒嗜性无关，但是可能与病毒毒力有关。强毒毒株和临床病料中分离的毒株都不含有127bp重复序列。[23]噬淋巴细胞型鼠微小病毒为强毒株，它也是缺失了65bp的重复序列。这种重复序列也许对于病毒的复制至关重要，1991年，Salvino等发现如果移除纤维素型鼠微小病毒中的4 [43]重复序列可以抑制病毒复制达10-100倍。PPV的衣壳蛋白，主要是VP2，对PPV的嗜性和毒力的强弱有着极大的影响。Chen等在1986年和Mengeling等在1988年对多种细小病毒衣壳蛋白的开放阅读框架进行同源性比较分析后，发现ORF2中有三处序列（分别被命名为“NPYL”，“TPW”和“PIW”）为高度保守序列，为所有细小病毒共有，而另一些保守序列（分别被命名为[11，44]“GGG”，“PGY”和“YNN”）为自主型细小病毒所固有。自主型细小病毒结构蛋白的主要作用是保护DNA物质、参与感染宿主细胞、在病毒的复制、转录和包装上都起着很重要的作用。研究表明VP2在聚集和包装子代单链DNA上发挥了重要的作用，VP1在病毒感染、进入宿主细胞的过程中发挥了重要的作用，即在与宿主细胞结合后、DNA开始复制之前发挥作用。VP1的N端含有碱性氨基酸残基富集区，有利于VP1与子代单链DNA结合，从而稳定单链DNA，促进DNA的复制与DNA[45][46]的包装。VP2能够与DNA的3’端的发卡结构相结合，但效率不如VP1。PPV的主[1，47]要结构蛋白VP2是PPV特异性中和抗体的靶蛋白。VP2上有9个B细胞线形表位，[48]但是只有N端肽段能够诱导病毒产生中和抗体，VP2在PPV感染的诊断上和免疫预防[49]上都发挥了重要的作用。目前，VP2已经在许多表达系统中得到表达，最常用的两种表达系统为pET表达系统和BEVS。pET表达系统是利用大肠杆菌表达目的蛋白功能最强大的系统。将重组质粒转化进入大肠杆菌后，利用IPTG诱导，几乎所有的细胞资源都会用于目的蛋白的表达，诱导表达仅仅几个小时，目的蛋白含量可达到细胞总蛋白的50%以上。不过，pET表达系统表达的目的蛋白经常以聚集的形式表达，即包涵体形式，通常情况下，降低蛋白的合成速率，如降低诱导温度会提高目的蛋白的可溶性，可溶性蛋白可应用于更多研究。Qi等通过优化感受态细胞和表达载体，建立一个表达可溶性VP2蛋白的方法，westernblot鉴定该[50]VP2能够与特异性血清发生反应。臧科伟等将原核表达的VP2作为包被抗原建立一个检[51]测PPV抗体的间接ELISA方法。BEVS中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾核型多角体病毒（AcNPV），通过体内同源重组的方法，用外源基因替代多角体病毒基因而构建重组病毒，重组病毒在昆虫细胞中大量复制表达从而达到表达目的蛋白的目的。Zhou等利用BEVS表达VP2，westernblot试验和血凝试验结果表明其能够与特异性血清发生反应并且具有血[52]凝活性。Rueda等利用BEVS表达VP2，应用免疫电镜观察其形态，证明VP2以VLPs形式表达，随后再利用高度纯化的VLPs建立双抗体夹心ELISA方法来测定VLPs的含量[2][53]。吕建强等利用BEVS表达VP2，用粗纯化VP2包被酶联板，建立了间接ELISA方法。5 1.3PPV疫苗研究进展PPV感染猪群后可导致母猪繁殖障碍，造成了巨大的经济损失。许多研究表明疫苗免[54-55]疫是控制该疾病的一个很有效的方法。猪体主要是通过产生体液免疫应答来获得针对[41]PPV感染的保护力。如果初产母猪在第一次怀孕之前已经获得针对PPV的主动免疫，[24]就可以避免由PPV感染引起的繁殖障碍。以下是几种疫苗的研究进展：1.3.1弱毒疫苗弱毒疫苗即活疫苗，是经过人工致弱后失去了对宿主的致病力，但仍然保持良好免疫原性的病原体，或者是自然弱毒病原体。1982年，Fujisaki等将HS90野毒株在猪肾细胞上进行低温培养，连续传代54代后得到HT变异株（低温细胞传代育成株），该毒株免疫猪体后能够产生高滴度抗体，而且不发[56]生病毒血症。1984年，Mengeling等将PPV强毒株在细胞上连续传代50次以上后致弱，即NADL-2弱毒株（细胞培养适应株），经分子生物学研究证实，相对于该毒株，强毒株NADL-8的VP2基因序列缺失了大小为300bp的片段，此弱毒株是最早应用于预防PPV[57]感染的弱毒疫苗。将该弱毒株经鼻内接种或者口服免疫PPV抗体阴性的怀孕母猪，可引发轻微的病毒血症，但是病毒不会穿过胎盘感染胎儿。我国学者也在PPV弱毒疫苗的研究中作出了贡献，杜坚、蒋玉雯、叶向阳等分别研制了PPV弱毒疫苗。弱毒疫苗具有用量少，产生抗体快，免疫力较强和成本低等优点。与灭活疫苗相比，弱毒疫苗产生的抗体水平较高且维持时间较长，通常可达数年，而灭活疫苗的免疫维持时间相对较短，一般只有半年。但是活PPV的大量存在很可能会发生病毒重组、毒力返强以及散毒，并且弱毒疫苗需要低温贮运，因此，PPV弱毒疫苗的应用一直都受到限制。1.3.2灭活疫苗目前，用于预防PPV的疫苗主要是灭活疫苗，即将病毒在猪源原代细胞上或建立好的细胞系上进行培养，然后将分离的感染性病毒用化学试剂灭活。常用的灭活剂有β-丙内酯（β-PL）、二乙烯亚胺（BEI）N-乙酰乙烯亚胺（AEI）和福尔马林等。1976年，Suzuki和Fujisaki用福尔马林灭活PPV后免疫仔猪，结果表明该种免疫试剂能够诱导产生高滴度抗体，首次研制出PPV灭活疫苗，不过这种灭活疫苗的保护力不太理[58]想。随后，Joo和Johnson在1977年用β-PL灭活PPV，这种灭活疫苗诱导机体产生的[59]抗体至少能够持续4个月。Mengeling在1979年用AEI灭活PPV后免疫母猪，母猪血6 清抗体的HI效价都有所升高，在怀孕40天左右进行攻毒，HI效价先是下降，而后HI效价大幅度升高，剖杀后取出胎儿，发现免疫灭活疫苗的母猪其胎儿存活率很高，胎儿没有产生抗体也没有检测出PPV。不过，未免疫的母猪攻毒后HI效价远远高于免疫的母猪，[60]而且其胎儿也产生了抗体并且检测出PPV，这说明这种灭活疫苗产生了免疫保护作用。Mengeling在1980年比较PPV和猪伪狂犬病毒的二价灭活疫苗和单价灭活疫苗的免疫反应情况，发现二价灭活疫苗诱导的抗体滴度比单价的灭活疫苗高，但是，这两种灭活疫苗的[61]保护效果不理想。试验证明，用福尔马林灭活的PPV制成的疫苗其保护效果没有使用β-PL和AEI灭活PPV制成的疫苗好。1987年，Brown等评价灭活疫苗对母猪繁殖障碍的保护力，发现对母猪免疫一次后虽然血清抗体HI效价为不可检测的水平，但是对母猪攻[62]毒后，灭活疫苗产生了免疫保护作用，使母猪没有出现繁殖障碍。在我国，潘雪珠、肖驰、吕建强等也相继研制出PPV灭活疫苗。佐剂是影响疫苗免疫效果的重要因素。佐剂能够改变抗原的物理性状，延缓抗原的降解与排除，使其在机体内能够长时间存留，从而能够更有效地刺激机体的免疫系统；佐剂能够刺激淋巴细胞增殖分化，可以增强单核巨噬细胞处理与提呈抗原的能力，从而增强和扩大免疫效应。不过，佐剂在刺激机体免疫系统的同时，也能够导致非特异性刺激和一些不良反应，佐剂产生的副作用包括肉芽肿性炎症，神经错乱和致癌。Molitor等利用13种不同佐剂制作成PPV灭活疫苗并进行免疫效果的比较研究，结果发现50%氢氧化铝胶、顺丁烯乙酰（EMA）、CP-20961（Avridin）、油水乳剂及dimethyl-dioctadecyl-ammoniumbromide（DDA）为佐剂时，诱导机体产生的抗体滴度较高，而使用SDS、SDS与氢氧化铝混合物、表面活性剂、氢氧化铝与表面活性剂混合物、百日咳杆菌与氢氧化铝混合物、L-121为佐[63]剂时，诱导机体产生的抗体滴度较低。灭活疫苗具有安全性好、不需要低温保存等优点。但是灭活疫苗也存在着免疫效果不稳定、整个生产流程昂贵、费力的缺点，并且由于在实际生产过程中需要处理大量的感染性病毒而存在一定的危险。考虑到安全性和实际操作性，一种新型疫苗被研制成功，并且[3]有望代替灭活疫苗。1.3.3基因疫苗基因疫苗又称DNA疫苗。将编码抗原蛋白的基因插入到表达载体上，然后将重组质粒导入受体体内（动物体内、动物细胞中、细菌或酵母中），抗原基因在宿主细胞中得到表达产生抗原蛋白，这种抗原蛋白即为基因疫苗。如果将重组质粒直接导入到动物体内，7 抗原基因在一段时间内持续表达，抗原蛋白不断地刺激机体的免疫系统产生免疫应答，继而达到防病的目的。抗原基因的体外表达系统包括原核表达系统和真核表达系统。原核表达系统主要通过大肠杆菌细胞进行表达，其具有表达周期短、收获大、表达的蛋白比较稳定且操作简便的优点，但是该系统能够表达的目的基因相对分子量有限，且不能对表达的蛋白进行一些翻译后的加工、修饰。真核表达系统主要通过真核细胞进行表达，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。BEVS（通过昆虫细胞进行表达）具有独特的生物学特性，近来备受关注，其优点为其组蛋白具有完整的生物学功能，能够对表达的蛋白进行翻译后的加工、修饰，使蛋白在结构和功能上接近于天然蛋白，其表达水平较高，能够容纳大分子片段的插入并且可以同时表达多个基因。BEVS表达的VP2可以自我组装成VLPs，这种VLPs在大小和形态上很接近于天然病[1][52]毒粒子。Zhou等利用BEVS表达VP2并进行纯化。VP2VLPs具有很高的免疫原性并[13]且在对母猪攻毒后能保护机体不发生繁殖障碍。VP2VLPs与灭活疫苗相相比，其不需要大量扩增感染性病毒并且其本质上较为安全。VP2VLPs除了应用于PPV基因疫苗的制备，它还有另一个很有意义的特性，即在VP2VLPs中插入外源性抗原表位，免疫机体后能够诱导产生辅助性T细胞反应（Th）和细胞毒性T细胞反应（CTL）。Lo-Man等将携带有CD8+或者CD4+细胞表位的VP2VLPs作为免疫试剂在不添加任何佐剂的情况下进行小[64]鼠单次免疫，结果表明其能够诱导机体产生强烈的Th和CTL反应。Sedlik等将淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）的CD8+T抗原表位插入到VP2基因中，利用BEVS表达[65]蛋白后免疫小鼠，结果表明其能够诱导机体产生高水平的CTL反应。但是这种基因疫苗也存在着潜在的危险，即在制作疫苗时可能夹杂重组杆状病毒污染物。Rueda等利用BEVS表达VP2VLPs并且纯化后分别用巴氏消毒法、变性剂（TritonX-100）灭活法和BEI灭活法进行重组杆状病毒的灭活，然后用电镜和血凝试验观察VP2VLPs的完整性和血凝活性，结果发现利用巴氏消毒法处理1h后，部分VP2VLPs被破坏。变性剂和BEI处理后，VP2VLPs能够保持原来的形态和血凝活性。将三种方法处理的VP2VLPs进行豚鼠免疫，免疫后三种VP2VLPs诱导产生的抗体水平相似，最后选择安全、快速、操作简便的[3]变性剂灭活法进行进一步的试验。Maranga等研究利用生物反应器大规模生产VP2VLPs[66]的方法。Maranga等研究利用BEVS表达VP2VLPs，免疫豚鼠后结果表明大规模生产[67]的VP2VLPs免疫效果同普通方法表达的VP2VLPs的免疫效果相似。Antonis等利用BEVS表达VP2VLPs，用其免疫豚鼠和猪体后证明其能够诱导产生较好的体液免疫应答[39]。8 1.4研究的目的及意义PPV感染多以无明显临床症状为主，直到母猪发生繁殖障碍才受到人们的重视，而此时，PPV的流行已经给养猪业造成了巨大的经济损失。VP2是构成病毒衣壳的主要蛋白，病毒感染时VP2被机体所识别，诱导机体产生中和抗体，因此，VP2是疫苗研究的首选蛋白。目前，VP2的表达常用pET表达系统和BEVS，pET表达系统具有操作简便，表达产物稳定的优点，BEVS具有表达蛋白更接近天然蛋白的优点。本试验利用BEVS和pET表达系统分别表达VP2，研究其是否能够形成VLPs，并通过免疫豚鼠评价其免疫原性，研究评价VP2VLPs作为亚单位疫苗的潜力。9 10 第二章VP2在杆状病毒表达载体系统中的表达2.1试验材料与器材2.1.1试验材料[68]Sf9昆虫细胞、PPV阳性血清、重组杆状病毒AcNPV-VP2、标准抗原PPVBQ-C株第10代病毒液由本实验室保存；1.5MTris(pH8.8)、1.0MTris(pH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、5×蛋白电泳缓冲液、5×SDS上样缓冲液、0.1%考马斯亮蓝染色液、膜转移液、封闭液、TBST缓冲液、PBS缓冲液由本实验室配制保存；胎牛血清（FBS）、Grace昆虫细胞培养基粉末购自Gibico公司；青链霉素购自哈药集团制药总厂；DAB显色液购自北京天根生化科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG购自Sigma公司；蛋白预染Marker购自Fermentas公司；30%丙烯酰胺、细胞裂解液、蛋白酶抑制剂购自碧云天生物技术研究所；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Pall公司；其它试剂均为国产分析纯产品。2.1.2主要试验器材HFsafe-1200型生物安全柜购自上海力申科学仪器有限公司；5804R台式低温离心机购自德国Eppendorf公司；AE-8135型蛋白电泳仪购自日本ATTO公司；通用型半干转印电泳仪购自凯元公司；TS-2000A多用脱色摇床购自海门市麒麟医用仪器厂；倒置显微镜购自Olympus公司；MIR-153型27℃恒温培养箱购自日本三洋公司；GHP-9270型37℃培养箱购自上海精宏设备有限公司；SC-316型4℃及-20℃冰箱购自海尔公司。2.2试验方法2.2.1重组杆状病毒在Sf9细胞中的培养（1）用10%FBSGrace完全培养液培养Sf9。（2）待细胞长至70%-80%且大多数细胞处于生长旺盛阶段时将AcNPV-VP2按10%接种于Sf9单层细胞，培养液为2%FBSGrace培养基，27℃培养96h。（3）收集细胞，2000rpm4℃离心30min，将细胞用原培养液1/10体积的PBS缓冲液洗涤两次后重悬。（4）用细胞裂解液裂解细胞，并加入适量蛋白酶抑制剂，冰浴30min，每10min颠倒混匀一次，12000rpm离心20min，吸取上清液待用。11 2.2.2VP2电镜观察（1）取裂解后的上清液1.5mL，10000rpm离心20min。（2）弃去大部分上清液，只留100μL上清液重悬沉淀。（3）磷钨酸染色观察是否形成VLPs。2.2.3VP2Westernblot试验（1）取裂解后上清液80μL加入5×SDS上样缓冲液20μL，混合后放入沸水中煮沸10min，12000rpm4℃离心1min。（2）取上清10μL加入蛋白胶加样槽中进行SDS-PAGE电泳，4%浓缩胶80V电泳30min，12%分离胶120V电泳1h。（3）将蛋白胶和同等大小的8层滤纸以及硝酸纤维素膜（NC膜）浸泡在膜转移液中5min。（4）由下至上依次放置4层滤纸、NC膜、蛋白胶、4层滤纸，擀尽气泡，盖上电极，接通电源，18V转膜30min。（5）将转膜后的NC膜浸入10mL由TBST缓冲液稀释的5%的脱脂乳中，4℃封闭过夜。（6）弃去封闭液，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min，然后将NC膜放入用5%脱脂乳稀释的一抗液（一抗为PPV阳性血清，1：200稀释）中，在轻柔晃动的摇床上常温孵育2h。（7）弃去一抗液，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min，然后将NC膜放入用5%脱脂乳稀释的二抗液（二抗为兔抗猪的IgG，1：5000稀释）中，在轻柔晃动的摇床上常温孵育1h。（8）弃去二抗液，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次，每次5min。配制显色液，取DAB显色液A液、B液、C液各一滴滴入1mL去离子水中，混匀后加到NC膜上显色3-5min，用去离子水洗膜终止反应，照相。2.2.4VP2血凝试验（1）Sf910%接毒后，27℃培养96h，收集的细胞在-20℃反复冻融3次。（2）将2-溴乙胺氢溴酸盐（BEA）加入到NaOH溶液中进行环化，在37℃孵育2h，制备BEI灭活剂用于灭活重组杆状病毒。（3）用1mM的BEI在27℃对反复冻融液进行灭活处理48h，得到灭活物。12 （4）将灭活物接种于Sf9单层细胞，27℃培养96h，连续重复传代培养三次，得到灭活物重复传代培养物，观察细胞病变情况和测定血凝活性。（5）在标准96孔U型微量反应板内每孔先加入50μL的PBS缓冲液，然后分别加入等体积AcNPV-VP2接毒Sf9细胞反复冻融液、灭活物，进行倍比稀释，最后加入PBS缓冲液稀释的0.6%豚鼠红细胞，每孔50μL，在37℃下作用2h后观察结果。未接毒的Sf9单层细胞收集后在-20℃反复冻融3次作为阴性对照，本实验室保存的PPV标准抗原用作阳性对照。2.2.5VP2纯化参照MERCK公司的His·Tag融合蛋白纯化操作手册的使用方法进行纯化，具体操作步骤如下：（1）收集接毒后的Sf9细胞，2000rpm4℃离心30min，将细胞用原培养液1/10体积的PBS缓冲液洗两次后重悬。（2）用细胞裂解液裂解细胞，并加入适量蛋白酶抑制剂，冰浴30min，每10min颠倒混匀一次，12000rpm离心20min，取上清。（3）将1mL50%Ni-NTAHis·Bind树脂悬液加入下端封闭的色谱柱中，开放色谱柱下端，排出乙醇液。（4）用盖子封闭色谱柱下端，再向色谱柱中加入4mL1×Ni-NTA结合缓冲液，轻柔地混匀，待树脂自然沉降后，拔下色谱柱下端盖子，让液体流出，再重复此步骤一次。（5）用盖子封闭色谱柱下端，加入4mL细胞裂解液处理后的上清液，用旋转混合器200rpm轻柔摇动混匀，4℃结合1h。（6）拔下色谱柱柱下端盖子，让液体流出，收集保存。（7）用4mL1×Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗两次，收集保存漂洗液。（8）用0.5mL1×Ni-NTA洗脱缓冲液洗脱蛋白四次。收集保存洗脱液。2.3结果2.3.1VP2电镜观察结果利用BEVS表达的VP2通过电镜观察发现其能够形成VLPs。13 图2.1VP2VLPs电镜观察结果Fig.2.1ResultofelectronmicroscopeobservationofVP2VLPs2.3.2VP2Westernblot试验结果未接毒的Sf9细胞裂解处理后作为阴性对照。Westernblot试验结果表明未接毒的Sf9细胞未显示有特异性条带，AcNPV-VP2接毒Sf9细胞裂解处理后显示有特异性条带，相对分子质量在64kDa处。M12130kDa95kDa72kDa64kDa55kDa43kDa34kDa26kDa17kDa图2.2Sf9细胞中表达的VP2Westernblot试验结果M：蛋白Marker；1：未接毒Sf9细胞；2：AcNPV-VP2接毒Sf9细胞Fig.2.2ResultofWesternblottestoftheVP2expressedinSf9cellsM:Proteinmarker;1:uninfectedSf9cells;2:AcNPV-VP2infectedSf9cells2.3.3VP2血凝试验结果未接毒的Sf9细胞反毒冻融处理后作为阴性对照，标准抗原作为阳性对照。血凝试验结果表明未接毒的Sf9细胞未显示有血凝活性，AcNPV-VP2接毒Sf9细胞反复冻融处理后1010血凝效价为1:2，利用BEI灭活杆状病毒后，血凝效价为1:2。灭活物重复传代三次均14 未发现细胞病变，灭活物重复传代培养物无血凝活性。123456789101122222222222122930425621078102161514132222图2.3Sf9细胞中表达的VP2的血凝试验结果1-2：标准抗原；3-4：未接毒Sf9细胞；5-6：AcNPV-VP2接毒Sf9细胞；7-8：灭活物Fig.2.3ResultofHAoftheVP2expressedinSf9cells1-2:standardantigen;3-4:uninfectedSf9cells;5-6:AcNPV-VP2infectedSf9cells;7-8:inactivatedmaterial2.3.4VP2纯化结果纯化后的VP2相对分子质量在64kDa处。M1170kDa130kDa95kDa72kDa64kDa55kDa43kDa34kDa26kDa图2.4VP2纯化结果M：蛋白Marker；1：纯化的VP2Fig.2.4ResultofpurificationofVP2M:Proteinmarker;1:purifiedVP215 2.4讨论BEVS具有高效表达外源基因、翻译后有效地加工修饰、对外源基因克隆容量大、重[69]组病毒易于筛选等优点，现已广泛应用于高价值外源蛋白的表达。这项技术首次问世以[70]来，各种生物体（动物、植物、细菌、病毒）的蛋白都可以通过这个表达系统得到表达。[71-74]BEVS最重要的技术突破是蛋白表达后进行形态观察发现其能够组装成VLPs。这些[72-73]VLPs具有显著的免疫原性，也有研究者对VLPs作为疫苗的潜力进行了评价。本试验应用BEVS表达PPV的主要结构蛋白VP2，VP2在该系统中自主组装成VLPs，[1，3]这与Martinez等1992年、Rueda等2000年的报道相吻合。VLPs为病毒的结构蛋白自主组装成的空心颗粒，其在形态上与真正的天然病毒粒子相同或相似，与活病毒相比，VLPs[75]没有感染性，也不能自主复制，因为它不含有病毒的核酸物质。VP2能够诱导机体产生中和抗体，从而对机体产生保护效力使机体免遭PPV的感染。Westernblot试验中，NC膜上的VP2与PPV阳性血清发生了特异性反应，BEVS表达的VP2具有与特异性血清结合的生物活性。VP2基因序列决定着细小病毒的组织嗜性、血凝活性、种系进化以及宿主范[17，23，36][24]围。PPV能够凝集人类、猫、猴子、豚鼠、大鼠、小鼠和鸡的红细胞。血凝试验中，BEVS表达的VP2VLPs血凝价较高，表明其具有血凝活性。VP2VLPs不仅在形态上与天然病毒粒子相似，在功能上也较为相近。在使用BEI灭活之前，VP2VLPs的血凝1010价为2，灭活之后血凝价仍然为2，将灭活物重复传代三次均未发现细胞病变，并且灭活物重复传代培养物无血凝活性，这表明灭活物在培养过程中不存在重组杆状病毒的复制。BEI灭活之后，VP2VLPs可应用于实验动物的免疫试验。16 第三章VP2在pET表达系统中的表达3.1试验材料与器材3.1.1试验材料PPVBQ-C株、PPV阳性血清、pET-28a载体由本实验室保存；50×TAE、1×TAE、无抗性LB液体培养基、含卡那霉素的LB液体培养基、含卡那霉素的LB平板培养基、1.5MTris(pH8.8)、1.0MTris(pH6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵、5×蛋白电泳缓冲液、5×SDS上样缓冲液、0.1%考马斯亮蓝染色液、膜转移液、封闭液、TBST缓冲液、PBS缓冲液由本实验室配制保存；引物由哈尔滨博士生物有限公司合成；PrimerSTAR高保真酶、5×PSBuffer、rTaqDNAPolymerase、10×PCRBuffer、dNTP、T4DNA连接酶、10×T4Buffer、BamHⅠ、XholⅠ、10×KBuffer、DL2000DNAMarker、DL15000DNAMarker、10×Loadingbuffer、E.ColiDH5α感受态细胞、BL21（DE3）感受态细胞均购自TaKaRa公司；琼脂糖购自Biowest公司；蛋白预染Marker为Fermantas公司产品；30%丙烯酰胺购自碧云天生物技术研究所；血液/细胞/组织DNA提取试剂盒、DAB显色液购自天根生化科技有限公司；质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒、卡那霉素（Kanamycin）购自上海华舜生物工程有限公司；琼脂糖购自Biowest公司；IPTG、TEMED、辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体均购自Sigma公司；硝酸纤维素膜（NC膜）购自Pall公司；柠檬酸钠购自天津化学试剂厂；其他常用试剂为进口分析纯。3.1.2主要试验器材TP-600型PCR仪购自日本TaKaRa公司；JD200-3型电子天平购自沈阳龙腾电子有限公司；DYY-8C型稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂；连接仪购自杭州大和热磁电子有限公司；SYNGENE型凝胶成像系统购自Gene公司；DK-8D型电热恒温水浴锅购自上海精宏设备有限公司；MZ-312型振荡培养箱购自上海精宏设备有限公司；5804R台式低温离心机购自德国Eppendorf公司；SW-CJ型超净台购自苏州安泰空气技术有限公司；SC-316型4℃及-20℃冰箱购自海尔公司；-80℃超低温冰箱购自Thermo公司；AE-8135型蛋白电泳仪购自日本ATTO公司；通用型半干转印电泳仪购自凯元公司；TS-2000A多用脱色摇床购自海门市麒麟医用仪器厂；超声波破碎仪购自美国BAKEMAN公司；MP220型pH计购自METTERTOLEDO公司；GHP-9270型37℃培养箱购自上海精宏设备有限公司。17 3.2试验方法3.2.1引物设计参照GeneBank中登陆的BQ株PPV序列（EU790641.1），应用Oligo6.0软件设计用于扩增VP2基因全长序列（在PPV基因组中的位置为2810bp-4549bp）的引物。引物为：P1：ACTGGATCCATGAGTGAAAATGTG，P2：ACTCTCGAGCTAGTATAATTTTCTTGGT，下划线代表酶切位点，P1的酶切位点为BamHⅠ，P2的酶切位点为XholⅠ。扩增序列大小预计为1758bp，引物由哈尔滨博士生物有限公司合成。3.2.2PPV基因组DNA的提取参照TIANGEN的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书操作。取200μLPPVBQ-C株第10代病毒液，加入20μL蛋白酶K溶液，充分混匀。（2）加入200μLGB缓冲液，颠倒混匀后，置于70℃水浴锅内10min，简短离心。（3）加入200μL无水乙醇，振荡混匀15s，简短离心。（4）将步骤（3）所得液体加入到吸附柱中，将吸附柱放入一个离心管中，12000rpm离心30s，弃去滤液。（5）向吸附柱中加入500μLGD缓冲液，12000rpm离心30s，弃去滤液。（6）向吸附柱中加入700μLPW漂洗液，12000rpm离心30s，弃去滤液。（7）重复步骤（6）。（8）12000rpm离心2min，换一个新的离心管，将吸附柱放在室温下晾干数分钟。（9）向吸附柱中央滴加50μLddH2O，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集溶液。3.2.3VP2基因全长序列的扩增[76]（1）根据戚亭等的方法，将反应体系设定为50μL体系：10μL5×PSBuffer，4μLdNTP，1μLP1（20μmol/L），1μLP2（20μmol/L），0.5μLPrimerSTAR高保真酶，1μLDNA模板，29.5μLddH2O。（2）反应条件为：预变性95℃，5min，变性94℃，30s，退火55℃，30s，延伸72℃2min，扩增循环30次，最后72℃总延伸10min，4℃保存。（3）用1×TAE配制1%的琼脂糖凝胶，加入5μLPCR产物，以DL2000Marker作为对照进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并记录结果。18 3.2.4PCR产物的纯化参照AXYGEN的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒说明书操作。（1）在紫外灯箱中切取含有目的DNA的琼脂糖凝胶，称取凝胶重量。（2）加入三个凝胶体积的DE-A缓冲液，混匀后置于75℃水浴锅中直至凝胶块完全熔化，每隔2-3min颠倒混匀一次。（3）加入0.5个DE-A缓冲液体积的DE-B缓冲液，混匀。（4）将混合后液体转移到吸附柱中，将吸附柱放入一个离心管中，12000×g离心1min，弃去滤液。（5）向吸附柱中加入500μLW1缓冲液，12000×g离心30s，弃去滤液。（6）向吸附柱中加入700μLW2缓冲液，12000×g离心30s，弃去滤液。重复此步骤。（7）12000×g离心1min，将吸附柱放入新的离心管中，在吸附柱中央加入30μL洗脱液，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。3.2.5重组质粒的构建（1）用BamHⅠ和XholⅠ双酶切PCR胶回收产物和pET-28a载体，酶切体系为50μL体系：5μL10×KBuffer，2μLBamHⅠ，2μLXholⅠ，10μLPCR胶回收产物/pET-28a，31μLddH2O，37℃水浴锅中酶切4h。（2）将酶切后的产物进行胶回收。（3）将PCR酶切胶回收产物与pET-28a酶切胶回收产物进行连接，连接体系为10μL体系：6μLPCR酶切胶回收产物，2μLpET-28a载体酶切胶回收产物，1μL10×T4Buffer，1μLT4DNA连接酶。16℃过夜连接。（4）10μL连接后产物加入到50μL的E.ColiDH5α，冰浴30min，之后42℃热休克90s，放在冰上静置3min。再加入500μL无抗性LB液体培养基，在37℃摇床上，180rpm震荡培养1h，取出后3000rpm离心3min，弃去上清400μL，留100μL重悬培养物，取50μL涂布于Kan抗性的LB平板上，37℃培养箱中培养过夜。（5）随机挑去LB平板上大小适中、边缘光滑整齐、圆润凸起的单菌落，接种于Kan抗性的LB液体培养基(100ng/μL)中，37℃过夜培养。3.2.6重组质粒的提取参照AXYGEN的AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明书操作。19 （1）取过夜培养的菌液，12000×g离心1min，弃上清。（2）加入250μLS1缓冲液悬浮细菌沉淀，悬浮均匀。（3）加入250μLS2缓冲液，充分地颠倒4-6次，使菌体充分裂解。（4）加入350μLS3缓冲液，充分地颠倒6-8次，12000×g离心10min。（5）将离心后上清转移至吸附柱中，将吸附柱放入离心管中，12000×g离心1min，弃去滤液。（6）加入500μLW1缓冲液，12000×g离心1min，弃去滤液。（7）加入700μLW2缓冲液，12000×g离心30s，弃去滤液。重复此步骤。（8）12000×g离心1min，将吸附柱放入新的离心管中，在吸附柱中央加入60μL洗脱液，室温静置1min，12000×g离心1min，收集溶液。3.2.7重组质粒的鉴定（1）单酶切鉴定为20μL体系：2μL10×HBuffer，1μLXholⅠ，6μL质粒，11μLddH2O，37℃水浴锅中酶切4h。（2）双酶切鉴定为20μL体系：2μL10×KBuffer，1μLBamHⅠ，1μLXholⅠ，6μL质粒，10μLddH2O，37℃水浴锅中酶切4h。（3）PCR鉴定，引物和反应条件都如VP2全长扩增部分所述，反应体系为50μL体系：5μL10×PCRBuffer，4μLdNTP，1μLP1（20μmol/L），1μLP2（20μmol/L），0.5μLrTaqDNAPolymerase，1μL质粒，34.5μLddH2O。（4）鉴定为阳性的质粒送测序，测序公司为北京华大基因科技有限公司。建立的质粒鉴定正确后命名为pET-28a-VP2。3.2.8重组质粒的表达（1）将pET-28a-VP2重组质粒按照转入E.ColiDH5α的方法转化表达感受态细胞BL21(DE3)，37℃培养过夜。（2）挑取单菌落接种于Kan抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。（3）将培养的菌液按1:100的比例接种于新鲜Kan抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600nm约为0.6-0.8时，诱导前取样作为对照。（4）然后加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导表达，37℃诱导4h。（5）诱导后的菌液，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体沉淀，沉淀用PBS缓冲液洗涤两次，最后用PBS缓冲液重悬。20 （6）重悬后的菌液进行超声破碎，超声5s，停5s，振幅为38%，总共超声20min。（7）超声后的菌液，12000rpm，4℃离心30min，收集上清和包涵体沉淀，沉淀用PBS缓冲液重悬。（8）pET-28a全菌诱导4h后用PBS缓冲液洗两次，再用PBS缓冲液重悬作为对照一。诱导前pET-28a-VP2菌液也用PBS缓冲液洗两次后再用PBS缓冲液重悬作为对照二。分别取两种对照以及pET-28a-VP2全菌诱导后超声上清和沉淀各80μL分别加入5×SDS上样缓冲液20μL，混合后放入沸水中煮沸10min，12000rpm4℃离心1min。（9）取10μL加入蛋白胶加样槽中进行SDS-PAGE电泳，4%浓缩胶80V电泳30min，12%分离胶120V电泳1h。3.2.9VP2电镜观察（1）取包涵体沉淀重悬液1.5mL，10000rpm离心20min。（2）弃去大部分上清液，只留100μL上清液重悬沉淀。（3）磷钨酸染色观察病毒样颗粒。3.2.10VP2Western-blot试验（1）SDS-PAGE电泳后，将蛋白胶上的蛋白转移到NC膜上，18V转膜30min。（2）将转膜后的NC膜浸入到5%的脱脂乳中，4℃封闭过夜。（3）用TBST缓冲液洗涤NC膜3次后常温孵育一抗（一抗为PPV阳性血清，1：200稀释）2h。（4）弃去一抗，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次后常温孵育二抗（二抗为兔抗猪的IgG，1：5000稀释）1h。（5）弃去二抗，用TBST缓冲液洗涤NC膜3次用DAB显色液加到NC膜上显色3-5min，用去离子水洗膜终止反应，之后照相。3.2.11VP2血凝试验在标准96孔U型微量反应板内每孔先加入50μL的PBS缓冲液，然后再加入等体积的包涵体沉淀重悬液，进行倍比稀释，最后加入0.6%豚鼠红细胞，每孔50μL，在37℃作用2h后观察结果。pET-28a-VP2全菌诱导前对照经过超声破碎后作为阴性对照，本实验室保存的PPV标准抗原用作阳性对照。21 3.2.12VP2纯化参照MERCK公司的His·Tag融合蛋白纯化操作手册的使用方法对包涵体进行变性纯化，具体步骤如下：（1）诱导后的菌液，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体沉淀，沉淀用1×Ni-NTA结合缓冲液洗涤两次，最后按每100mL培养基所得菌体加入40mL1×Ni-NTA结合缓冲液比例重悬菌体。（2）重悬后的菌液进行超声破碎，超声5s，停5s，振幅为38%，总共超声20min。（3）超声后的菌液，12000rpm，4℃离心30min。（4）除去上清，每100mL培养物的沉淀重悬于20mL1×Ni-NTA结合缓冲液，12000rpm，4℃离心30min。（5）除去上清，每100mL培养物所得沉淀重悬于5mL含8M尿素缓冲液（BufferB，PH8.0）。（6）冰浴孵育1h以溶解包涵体。15000rpm离心30min去除不溶成分，在过柱纯化之前用0.45μm滤膜过滤上清。（7）将1ml50%Ni-NTAHis·Bind树脂悬液加入下端封闭的色谱柱中，开放色谱柱下端，排出乙醇液。（8）用盖子封闭色谱柱下端，再向色谱柱中加入4mL1×Ni-NTA结合缓冲液，轻柔地混匀，待树脂自然沉降后，拔下色谱柱下端盖子，让液体流出，再重复此步骤一次。（9）用盖子封闭色谱柱下端，加入4mL包涵体溶解液，用旋转混合器200rpm轻柔摇动混匀,4℃结合1h。（10）拔下色谱柱下端盖子，收集保存流出液。（11）用4mLC缓冲液（PH6.3）漂洗杂蛋白2次。收集保存漂洗液。（12）用0.5mLD缓冲液（PH5.9）洗涤蛋白4次，收集保存洗涤液。（13）分别用0.5mL的PH4.5、PH4.4、PH4.3、PH4.2、PH4.1和PH4.0的E缓冲液洗脱目的蛋白，收集保存洗脱液。3.3结果3.3.1VP2基因全长序列的扩增结果扩增片段经过凝胶电泳后得到条带大小与预期大小1758bp相符，可初步确定为VP2基因片段。22 M122000bp1758bp1000bp750bp500bp250bp100bp图3.1PCR扩增VP2基因结果M：DL2000Marker；1：阴性对照；2：PCR扩增产物Fig.3.1ResultofamplicationoftheVP2genebyPCRM:DL2000Marker;1:negativecontrol;2:PCRproduct3.3.2重组质粒的鉴定结果利用XholⅠ单酶切重组质粒经过凝胶电泳后得到条带大小与预期大小7075bp相符。利用BamHⅠ和XholⅠ双酶切重组质粒经过凝胶电泳后得到两条条带，大小与预期大小相符，分别为1746bp和5329bp。利用PCR对重组质粒进行VP2全长序列的扩增，凝胶电泳结果显示得到条带大小与预期大小1758bp相符。M112315000bp10000bp7500bp5000bp2500bp2000bp1000bp1000bp750bp500bp250bp250bp100bp图3.2pET-28a-VP2单酶切、双酶切和PCR鉴定结果M1：DL15000Marker；1：pET-28a-VP2单酶切；2：pET-28a-VP2双酶切；3：PCR鉴定；M2：DNAMarkerDL2000Fig.3.2ResultsofidentificationofpET-28a-VP2bysingleenzymedigestion,doubleenzymedigestionandPCRM1:DL15000Marker;1:singleenzymedigestion;2:doubleenzymedigestion;3:PCR;M2:DNAMarkerDL20003.3.3重组质粒的表达结果SDS-PAGE凝胶电泳结果表明，VP2在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达并且为包涵体形式。VP2分子量大约在64kDa。23 M1234170kDa130kDa95kDa72kDa64kDa55kDa43kDa34kDa26kDa17kDa图3.3VP2SDS-PAGE鉴定结果M：蛋白Maker；1：pET-28a全菌诱导对照；2：pET-28a-VP2全菌诱导前对照；3：pET-28a-VP2全菌诱导后超声上清；4：pET-28a-VP2全菌诱导后超声沉淀Fig.3.3ResultofSDS-PAGEanalysisofVP2M:Proteinmarker;1:thewholebacteriumofpET-28aafterinduction;2:thewholebacteriumofpET-28a-VP2beforeinduction;3:thesupernatantofinducedwholebacteriumofpET-28a-VP2aftersonication;4:thepelletofinducedpET-28a-VP2aftersonication3.3.4VP2电镜观察结果利用pET表达系统表达的VP2通过电镜观察没有发现VLPs的形成。图3.4VP2电镜观察结果Fig.3.4ResultofelectronmicroscopeobservationofVP23.3.5VP2Westernblot试验结果Westernblot试验结果表明超声后上清和沉淀都有特异性条带，相对分子质量在64kDa处，所得VP2与PPV阳性血清发生特异性反应。24 M1234170kDa130kDa95kDa72kDa64kDa55kDa43kDa34kDa26kDa17kDa图3.5全菌中表达的VP2Westernblot试验结果M：蛋白Maker；1：pET-28a全菌诱导对照；2：pET-28a-VP2全菌诱导前对照；3：pET-28a-VP2全菌诱导后超声上清；4：pET-28a-VP2全菌诱导后超声沉淀Fig.3.5ResultofWesternblottestoftheVP2expressedinwholebacteriumM:Proteinmarker;1:thewholebacteriumofpET-28aafterinduction;2:thewholebacteriumofpET-28a-VP2beforeinduction;3:thesupernatantofinducedwholebacteriumofpET-28a-VP2aftersonication;4:thepelletofinducedpET-28a-VP2aftersonication3.3.6VP2血凝试验结果血凝试验结果表明只有PPV标准抗原具有血凝活性，pET表达系统表达的VP2没有血凝活性。123456789101122222222222120292302图3.6全菌中表达的VP2的血凝试验结果1：pET-28a-VP2全菌诱导前对照；2：标准抗原；3：pET-28a-VP2全菌诱导后超声沉淀Fig.3.6ResultofHAoftheVP2expressedinwholebacterium1:thewholebacteriumofpET-28a-VP2beforeinduction;2:standardantigen;3:thepelletofinducedpET-28a-VP2aftersonication3.3.7VP2纯化结果纯化后的VP2相对分子质量在64kDa处。25 M195kDa72kDa64kDa55kDa43kDa34kDa26kDa图3.7VP2蛋白纯化结果M：蛋白Marker；1：纯化的VP2Fig.3.7ResultofpurificationofVP2M:Proteinmarker;1:purifiedVP23.4讨论电镜观察结果表明，pET表达系统表达的VP2不能形成VLPs。在pET表达系统中，由于缺乏有效地加工折叠处理，表达的VP2不具备天然病毒粒子的形态。Westernblot试验结果表明原核表达的VP2能够与PPV阳性血清发生特异性反应，说明原核表达的VP2具有抗原结构域。血凝试验结果表明原核表达的VP2没有血凝活性。血凝活性位点位于结构蛋白上，结构蛋白缺失几个氨基酸即失去血凝活性，恢复这几个氨基酸以后，其血凝活性也得到恢复[1]。原核表达的VP2是包涵体，不具备病毒的天然构象，可能是蛋白在表达过程中未经加工处理，其血凝活性位点缺失相关氨基酸，因此不能凝集红细胞。26 第四章纳米PCR检测方法的建立4.1试验材料猪的主要病毒核酸包括PPVBQ-C株DNA、猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）SH株DNA、猪捷申病毒（PTV-8）cDNA、猪伪狂犬病毒（PRV）JL株DNA、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）HB株cDNA、猪瘟病毒（CSFV）cDNA、PPVBQ-C株第10代病毒液由本实验室保存；检测的病料为黑龙江、河北和河南3个省份的43份临床疑似PPV感染组织样品，主要包括发病猪的心、肝、脾、肺、肾等组织；PrimerSTAR高保真酶、DL2000Marker、DNAA-TailingKit、pMD18-T载体、E.ColiDH5α感受态细胞、2×GCbufferⅡ购自TaKaRa公司；琼脂糖购自Biowest公司；质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司；胶回收试剂盒购自AXYGEN公司；纳米PCR试剂盒购自山东大正医疗器械股份有限公司。4.2试验方法4.2.1引物设计根据网上公布的VP2基因全长序列，进行序列比对后筛选保守区域，应用Oligo6.0软件设计扩增VP2基因部分序列（在PPV基因组中的位置为3002bp-3473bp）的引物。引物为：P3：CACGCATCAAGACTCATA，P4：TTGGTGGATTTAGGTTTC，扩增序列大小预计为472bp，引物由哈尔滨博士生物有限公司合成。4.2.2VP2重组质粒模板的制备（1）以PPVBQ-C株第10代病毒液提取的DNA为模板，应用PrimerSTAR高保真酶以P1/P2作为引物，扩增VP2基因全长序列，PCR产物进行胶回收纯化。（2）PCR产物加“A”处理，体系为50μl体系：5μL10×A-TailingBuffer，4μLdNTPMixture（2.5mmol），0.5μLA-TailingEnzyme，30μlPCR产物，10.5μLddH2O，72℃水浴锅20min，再冰浴2min。（3）加“A”的PCR产物胶回收纯化后与pMD18-T载体进行连接，体系为13μL体系：1μLpMD18-T载体，5μLSolutionⅠ，7μL加“A”的PCR产物，16℃连接过夜。（4）连接后将连接产物转化到50μL的E.ColiDH5α中，转化后涂布于Amp抗性的LB平板上，挑去单菌落置于Amp抗性的LB液体培养基中，提取重组质粒经过PCR鉴定27 和测序正确后作为纳米PCR检测方法中的阳性模板，命名为pMD-VP2。4.2.3纳米PCR检测方法的建立以及条件优化[77]（1）根据马兴杰等的方法，将纳米PCR反应体系预设定为：6μL2×nanobuffer，0.6μLP3（10μmol/L），0.6μLP4（10μmol/L），0.8μLpMD-VP2(100ng/μL)，0.2μLTaq酶(5U/μL)，ddH2O补足到12μL，反应条件预设定为：预变性94℃，5min，变性94℃，30s，退火50℃，30s，延伸72℃40s，扩增循环30次，最后72℃总延伸7min，4℃保存。普通PCR反应体系中，缓冲液为不含有纳米颗粒的2×GCbufferⅡ，同时添加dNTP，其他的反应试剂和反应条件与优化的纳米PCR相同。（2）退火温度的优化：利用温度梯度PCR仪设置温度为46℃~55℃，间隔1℃，进行退火温度优化，反应体系和其他反应条件都相同。（3）引物浓度的优化：引物（初始浓度为10μmol/L）的使用体积从0.2μL到1.2μL进行优化，间隔0.2μL，优化的各组引物的终浓度为1/6μmol/L~6/6μmol/L，反应条件以优化后的退火温度为准。4.2.4敏感性试验阳性模板测定浓度（100ng/μL）后根据浓度计算拷贝数，10倍倍比稀释后得到浓度梯10度标准品，其浓度范围为4拷贝/μL~4×10拷贝/μL。分别利用纳米PCR和普通PCR对倍比稀释的阳性模板进行扩增，借此比较纳米PCR和普通PCR的敏感性。4.2.5特异性试验应用纳米PCR分别对PPV、PCV2和PRV的DNA以及PTV-8、PRRSV和CFSV的cDNA进行检测，以此验证纳米PCR的特异性。4.2.6纳米PCR与普通PCR对临床样品的检测比较将43份临床组织样品分别剪碎、研磨，参照TIANGEN的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，提取的DNA分别应用纳米PCR和普通PCR进行检测。4.3结果4.3.1阳性模板的制备以PPV细胞培养物提取的DNA作为模板，利用特异性引物进行VP2基因全长序列的扩增，结果获得1758bp特异性产物。将扩增产物经过胶回收纯化后连接到pMD18-T载28 体中构建重组质粒，鉴定正确，重组质粒构建成功，命名为pMD-VP2，作为PCR的阳性模板。4.3.2纳米PCR检测方法的建立以及条件优化根据预设定的反应体系和反应条件进行各种条件的优化，最终确定纳米PCR退火温度为48℃。M12345678910112000bp1000bp750bp500bp472kb250bp100bp图4.1纳米PCR温度优化M：DL2000Marker；1：阴性对照；2-11：分别为46，47，48，49，50，51，52，53，54，55℃Fig.4.1OptimizationoftemperatureofnanoPCRM:DL2000Marker;1:negetivecontrol;2-11:46,47,48,49,50,51,52,53,54,55℃,respectively根据预设定的反应体系和反应条件进行各种条件的优化，最终确定添加引物体积为0.6μL（引物终浓度为1/2μmol/L）。M1234562000bp1000bp750bp500bp472kb250bp100bp图4.2纳米PCR引物浓度优化M：DL2000Marker；1-6：分别为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μl；7：阴性对照Fig.4.2OptimizationofprimersconcentrationofnanoPCRM:DL2000Marker;1-6:0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2μl,respectively;7:negetivecontrol反应体系最终确定为：6μL2×nanobuffer，0.6μLP3/P4（10μmol/L），0.8μLpMD-VP2（100ng/μL），0.2μLTaq酶（5U/μL），ddH2O补足到12μL；反应条件为：94℃5min；94℃30s、48℃30s、72℃40s，共30个循环；72℃7min。普通PCR反应体系中添加4.5μL2×GCbufferⅡ和1.5μLdNTP，其他试剂和反应条件同纳米PCR。4.3.3敏感性试验敏感性试验结果表明，纳米PCR的最低检出量为4拷贝/μL（图4.3A），而普通PCR3的最低检出量为4×10拷贝/μL（图4.3B），纳米PCR比普通PCR敏感1000倍。29 M1234567891011ABB图4.3纳米PCR（A）和普通PCR（B）的敏感性试验10987M：DL2000Marker；1：阴性对照；2-12：分别为4×10，4×10，4×10，4×10，4654321×10，4×10，4×10，4×10，4×10，4×10，4拷贝/μLFig.4.3SensitivitytestsofthenanoPCR(A)andconventionalPCR(B)109876M：DL2000Marker;1:Negetivecontrol;2-12:4×10,4×10,4×10,4×10,4×10,543214×10,4×10,4×10,4×10,4×10,4copies/μL,respectively4.3.4特异性试验特异性试验结果显示，应用纳米PCR对六种猪的主要病毒DNA或者cDNA进行检测，只有PPVDNA为模板时扩增出472bp特异性条带，其他五种病毒检测结果均呈阴性，表明该纳米PCR具有良好的特异性。M12345672000bp1000bp750bp500bp472kb250bp100bp图4.4纳米PCR的敏感性试验M：DL2000Marker；1：阴性对照；2：PPV；3：PCV2；4：PTV-8；5：PRV；6：PRRSV；7：CFSVFig.4.4SpecificitytestofthenanoPCRM:DL2000Marker;1:Negetivecontrol;2:PPV;3:PCV2;4:PTV-8;5:PRV;6:PRRSV;7:CFSV4.3.5临床样品的检测分别用纳米PCR和普通PCR对3个省份送检的43份临床样品进行检测。结果显示，纳米PCR检测出41份临床样品为PPV阳性，阳性率为95%，而普通PCR检测出31份临床样品为PPV阳性，阳性率为72%，表明该纳米PCR相对于普通PCR更加敏感，适用于低含量PPV临床样品的检测。4.4讨论本试验分别对温度和引物浓度进行优化，根据优化的反应体系和反应条件进行下一步的试验，保证随后的试验在最优的条件下进行。30 将重组质粒进行10倍倍比稀释作为模板进行敏感性试验，分别用纳米PCR和普通PCR进行目的条带的扩增，纳米PCR的最低检出量为4拷贝/μL，而普通PCR的最低检出量为34×10拷贝/μL，结果表明纳米PCR比普通PCR敏感1000倍。纳米PCR使用的缓冲液中含有粒径为1-100nm的固体纳米金属颗粒，当反应时纳米金属颗粒悬浮在液体里形成纳米[78]流体，这种纳米流体比普通流体具有更强的导热性，高导热性使PCR很快达到目标温度，因此这种高热导性增加反应停留在特异性反应的时间，增大扩增效率，提高反应敏感性。特异性试验以PPVDNA和其他五种猪的主要病毒核酸为模板进行目的片段的扩增，结果表明只有PPVDNA作为模板时，才扩增出特异性条带，其他五种猪的主要病毒核酸都检测为阴性，纳米PCR具有良好的特异性。在含有纳米金属颗粒的反应体系中，PCR能够很快地达到目标温度，继而减少反应停留在非目标温度时间，最终达到消除非特异性[78-79]扩增，提高特异性扩增产量的目的。目前，检测PPV的PCR主要包括普通PCR和荧光定量PCR。在临床应用中，普通PCR较为常用，但是其敏感性不显著，荧光定量PCR较为精准，但是需要精密的仪器且操作程序复杂。纳米PCR是一种新型的PCR技术，它比普通PCR更加敏感，比荧光定量PCR更加方便快捷。临床上，在PPV感染初期或者后期病毒载量较低时，应用纳米PCR检测PPV能够更加高效，重要的一点是该方法适合于基层实验室的使用。本研究中分别应用纳米PCR和普通PCR检测临床样品，纳米PCR检测阳性率为95%（41/43），而普通PCR检测阳性率为72%（31/43），结果表明纳米PCR比普通PCR更加敏感。该PPV纳米PCR具有较高的敏感性和特异性，是一种高效的检测工具，可应用于流行病学调查。31 32 第五章VP2亚单位疫苗免疫豚鼠试验5.1试验材料PPVBQ-C株第10代病毒液、ST细胞和PPV阳性血清、MontanideISA15AVG佐剂由本实验室保存；400-600g成年健康豚鼠购自于哈尔滨医科大学二院动物实验中心；胎牛血清、RPMI1640培养基购自Gibico公司；辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG购自Sigma公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。5.2试验方法5.2.1豚鼠试验免疫方案选择400-600g的雌性豚鼠和雄性豚鼠分别为15只和12只，共27只，将豚鼠随机分七组，分别为Ⅰ组（灭活疫苗1.5mL/只）、Ⅱ组（灭活疫苗0.5mL/只）、Ⅲ组（VLPs300μg/只）、Ⅳ组（VLPs100μg/只）、Ⅴ组（VP2300μg/只）、Ⅵ组（VP2100μg/只）和Ⅶ组（非免疫）。除Ⅰ组和Ⅱ组，其他免疫组的免疫试剂均与MontanideISA15AVG佐剂按照蛋白：佐剂为85:15的比例进行乳化。总共进行两次免疫接种，免疫方式为后腿肌肉注射。免疫后每周心脏采血测定抗体效价。一免后进行两次采血，二免后进行四次采血。5.2.2血凝抑制试验（1）将本实验室的标准抗原PPVBQ-C株第10代病毒液稀释成4倍抗原，该病毒液99的血凝效价是2，抗原做2/4=128倍稀释，用PBS配制成4单位抗原。（2）取100μL待检血清，在56℃水浴锅中灭活处理30min，加入200μL25%白陶土悬液，混匀后室温作用30min，4000rpm离心10min，吸取上清，加入100μL20%豚鼠红细胞泥，振荡混匀后37℃作用1h；4000rpm离心10min，吸取上清，即为1：4稀释的血清样品。（3）在标准96孔U型微量反应板各孔中都加入50μLPBS。（4）第1孔中加入处理后的待检血清50μL，混匀，取出50μL加至第2孔，依此类推，直到第14孔，弃去50μL，此时待检血清的稀释度分别为1：23，1：24…1：216。第15孔和前14个孔每孔加入4单位抗原50μL，此时第15孔即为病毒对照孔，振荡摇匀，33 至37℃作用1h，第1孔到第16孔每孔加入0.6%豚鼠红细胞悬液50μL，振荡混匀，置室温37℃作用2h，观察结果。（5）以能抑制50%红细胞凝集的血清最高稀释倍数作为被检血清的HI抗体效价。5.2.3病毒TCID50的测定（1）将ST细胞接种于96孔板，每孔200μL，37℃培养72h。-1-10（2）在离心管中将本实验室的PPVBQ-C株第10代病毒液做10-10倍稀释，稀释液为2%FBS1640培养基。（3）将倍比稀释的病毒液加入96孔板中，每孔200μL，每一个稀释度的病毒液重复8个孔，并设置正常细胞对照，将96孔板放入37℃培养箱中培养48h。（4）用PBS缓冲液洗板2次，甩干后置于通风橱内干燥30min。（5）用33%丙酮-PBS固定液固定细胞，每孔100μL，室温固定20min。（6）甩出固定液后，置于通风橱内干燥30min。（7）将PPV阳性血清用PBS缓冲液做作1:200倍稀释，将稀释后的血清加入到96孔板中，每孔50μl，置于37℃孵育2h。（8）用PBS缓冲液洗板3次。将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG用PBS缓冲液作1:2500倍稀释，将稀释后的二抗加入到96孔板中，每孔50μL，置于37℃孵育1h。（9）用PBS缓冲液洗板3次，将显色液加入到96孔板中，每孔50μL，大概显色5-10min，用蒸馏水终止反应，在电子显微镜下观察结果。（10）按Reed-Muench法公式计算半数感染量。5.2.4攻毒以及保护效力的评价二免第四周后对所有豚鼠进行攻毒，攻毒液为PPVBQ-C株第10代病毒液7.83（10TCID50/mL），攻毒剂量为1mL，攻毒方式是后腿部肌肉注射配合背部多点注射，攻毒一周后将豚鼠处死，取脾脏进行淋巴细胞增殖试验观察细胞免疫情况。取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行PPV纳米PCR检测，评价各组免疫试剂的保护力。5.2.5淋巴细胞增殖试验（1）豚鼠心脏采血致死后，浸泡于75%酒精中5min，在超净台中无菌取脾脏置于无菌培养皿中。（2）于200目铜网中用注射器内胆研磨，用2mL10%FBS1640培养基研细研碎，再用3mL吹下铜网上残留的脾细胞，制备成脾细胞悬液。34 （3）将脾细胞悬液加入到离心管中，1200rpm4℃离心6min，弃去上清。（4）加入10mL红细胞裂解液（0.75%Tris-NH4Cl，pH7.4），重悬沉淀，37℃作用5min，1200rpm4℃离心6min。（5）用10mL1640培养液洗细胞2次，1200rpm4℃离心6min，弃去上清。（6）加入5mL含10%FBS1640培养液重悬，取10μL细胞悬液与10μL台酚兰（0.4%）6混合计数，计数时将淋巴细胞置于冰上，细胞计数后调整细胞浓度至5×10个/ml。（7）刺激孔（重复3个孔）中每孔加入100µL稀释后的细胞悬液和50µL10μg/mL的ConA溶液。非刺激孔（重复3个孔）中每孔加入100µL细胞悬液和50µl10%FBS1640培养液。（8）将培养板放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养54h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)15µL，继续培养4h。（9）将板内液体轻轻扣在吸水纸上吸净，每孔加入DMSO150µL溶解沉淀；用酶标仪测定570nm处的吸光值。5.2.6纳米PCR检测（1）将各组豚鼠的内脏组织进行剪碎研磨后，参照TIANGEN的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA。（2）利用纳米PCR检测各脏器中是否存在PPV。PPVDNA为阳性对照，ddH2O为阴性对照。5.3结果5.3.1血凝抑制试验结果灭活疫苗免疫分为两组，Ⅰ组和Ⅱ组。一免后这两组豚鼠抗体效价都有所升高，一免后一周抗体效价都开始下降。二免后，抗体效价又迅速升高，Ⅰ组在二免后二周抗体效价达到最高，之后抗体逐渐下降；Ⅱ组在二免后二周效价达到最高，持续了一周后，二免三周效价开始下降。二免后Ⅰ组的抗体水平总体高于Ⅱ组的抗体水平。VLPs免疫分为两组，Ⅲ组和Ⅳ组。一免后这两组豚鼠抗体效价都有所升高，一免后一周抗体效价都开始下降。二免后，抗体效价迅速升高，两组的抗体水平在二免后二周达到最高，高水平抗体维持一周，之后抗体效价都略有下降，这个趋势与Ⅰ组和Ⅱ组抗体效价发展趋势相似。Ⅲ组和Ⅳ组抗体变化趋势基本一致，二免三周时抗体水平开始下降，Ⅲ35 组诱导的体液免疫效果较好。在一免二周到二免二周这段时间，Ⅲ组和Ⅳ组的抗体水平比Ⅰ组低，但是比Ⅱ组高，在二免三周到二免四周这段时间，Ⅲ组和Ⅳ组的抗体水平要比Ⅰ组和Ⅱ组高。VP2免疫分为两组，Ⅴ组和Ⅵ组。一免后两组豚鼠抗体效价都有所升高，一免后一周抗体效价都有所下降。二免后，抗体逐渐升高，Ⅴ组抗体升高幅度比Ⅵ组大，两组的抗体水平在二免后二周达到最高，之后抗体效价开始逐渐下降，抗体下降幅度较大。Ⅴ组和Ⅵ组其免疫效果不如Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组。Ⅶ组为非免疫对照组，在整个过程中免疫效价维持在一个较低且稳定的水平。图5.1血凝抑制试验测定豚鼠抗体结果（↑表示免疫时间）Fig.5.1ResultsofdetectionofguineapigsantibodybyHI.Arrows(↑)representtimeofimmunization5.3.2淋巴细胞增殖试验结果本试验为攻毒后对豚鼠的淋巴细胞活性进行评价。各个免疫组又分为刺激组与未刺激组，刺激组与未刺激组相对比，刺激组的淋巴细胞都发生了不同程度的增殖。其中，对照组淋巴细胞增殖程度较其他免疫组的增殖程度小，说明该组淋巴细胞活性较弱。图5.2淋巴细胞增殖试验结果Fig.5.2Resultsoflymphocyteproliferationtest36 5.3.3纳米PCR检测结果攻毒后，应用纳米PCR检测各免疫组豚鼠的内脏，结果表明各免疫组豚鼠的内脏均未检出PPV，说明三种免疫试剂都对豚鼠机体产生保护力。M123456789101112131415161718192021222000bpA1000bp750bp500bp472kb250bp100bp2000bpB1000bp750bp500bp472kb250bp100bp图5.3纳米PCR的样品检测M：DL2000Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；（A）3-7：Ⅰ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾；8-12：Ⅱ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾；13-17：Ⅲ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾；18-22：Ⅳ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾；（B）3-7：Ⅴ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾；8-12：Ⅵ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾Fig.5.3DetectionofsamplesbythenanoPCRM:DL2000Marker;1:Negetivecontrol;2:Positivecontrol;(A)3-7:OrgansofguineapigingroupⅠ;8-12:OrgansofguineapigingroupⅡ;13-17:OrgansofguineapigingroupⅢ;18-22:OrgansofguineapigingroupⅣ;(B)3-7:OrgansofguineapigingroupⅤ;8-12:OrgansofguineapigingroupⅥ攻毒后，应用纳米PCR检测对照组豚鼠的内脏，结果表明该组豚鼠的心脏，脾脏和肺脏中都检测出PPV。M1234562000bp1000bp750bp500bp472kb250bp100bp图5.4纳米PCR的样品检测M：DL2000Marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-7：Ⅶ组豚鼠心、肝、脾、肺、肾Fig.5.4DetectionofsamplesbythenanoPCRM:DL2000Marker;1:Negetivecontrol;2:Positivecontrol;3-7:OrgansofguineapigingroupⅦ37 5.4讨论5.4.1血凝抑制试验研究表明，HI抗体滴度与血清中和抗体滴度之间呈正相关，即HI抗体水平能够反应免[17]疫试剂的保护能力。灭活疫苗免疫包括两组，Ⅰ组和Ⅱ组。一免后这两组豚鼠血清抗PPV抗体效价都有所升高，一免后一周抗体效价都有所下降。二免后，抗体效价再一次升高，且升高幅度增大，二免为加强免疫，一免使机体产生免疫记忆，机体再次受抗原刺激后，免疫记忆细胞可迅速增殖分化，所以二免后抗体快速上升且升高幅度较大。一免后这两组的抗体变化趋势和变化幅度相似。二免后这两组的抗体水平有所不同，Ⅰ组在二免后二周抗体效价达到最高，之后抗体逐渐下降；Ⅱ组在二免后二周效价达到最高，持续了一周后，二免三周效价开始下降，Ⅰ组的抗体效价总体水平高于Ⅱ组，说明免疫剂量大的免疫试剂能诱导较高水平的体液免疫反应。VLPs免疫包括两组，Ⅲ组和Ⅳ组。一免后这两组豚鼠抗体效价开始升高，一免后一周抗体效价都下降。二免后，抗体效价迅速大幅度升高，这是免疫记忆发挥作用的结果。Ⅲ组和Ⅳ组抗体变化趋势基本一致，不过，一免后，Ⅲ组诱导的抗体水平略高于Ⅳ组，直到二免后二周这两组所诱导的抗体水平才达到一致，二免三周时抗体水平开始下降，Ⅳ组抗体下降幅度较大，说明免疫剂量大的免疫试剂能诱导较高水平的体液免疫反应。VP2免疫包括两组，Ⅴ组和Ⅵ组。一免后两组豚鼠抗体效价都有所升高，一免后一周抗体效价都有所下降。二免后，抗体逐渐升高，升高幅度比一免后的抗体升高幅度稍大一些，这是免疫记忆发挥作用的结果。两组的抗体水平在二免后二周达到最高，之后抗体效价开始逐渐下降。这两组豚鼠的抗体水平总共出现了两个高峰，Ⅴ组峰值明显高于Ⅵ组，说明免疫剂量大的免疫试剂能诱导较高水平的体液免疫反应。对照组在整个过程中其免疫效价维持在一个较低且稳定的水平。整体来说，Ⅲ组和Ⅳ组抗体变化趋势基本一致并且抗体水平都较高，其抗体整体水平比Ⅱ组高，不过，二免后Ⅰ组的抗体水平大幅度升高，所达到的最高抗体水平高于任何一个免疫组，Ⅲ组和Ⅳ组所诱导的抗体水平不如Ⅰ组。Ⅲ组和Ⅳ组抗体水平在二免三周之后都高于其他免疫组，其抗体维持在高水平比其他免疫组稍长一些。VLPs在形成过程中利用真核细胞的蛋白包装加工系统进行自我装配，因此这种蛋白具有和天然病毒粒子相似的构象与功能。衣壳蛋白VP2是PPV的主要保护性抗原，而灭活疫苗在制作过程中可能破38 坏了部分成分，灭活疫苗的有效成分可能少于VLPs，从而VLPs免疫组诱导的抗体水平较高。Ⅴ组和Ⅵ组抗体整体水平低于其他免疫组。原核表达的VP2在形成过程中缺少包装等加工过程，因此原核表达的VP2在结构和功能上都不如灭活的PPV和VLPs，免疫原性和反应原性都较差，诱导的体液免疫反应水平较低。本试验的试验动物为豚鼠，虽然豚鼠对PPV敏感，但是，豚鼠毕竟不是PPV的本体动物，所以PPV相关免疫试剂免疫豚鼠后能够诱导的抗体水平有限，因此，评价免疫试剂的免疫原性还需要在本体动物即猪体上进行试验。选择豚鼠作为本试验的试验动物意在评价VP2亚单位疫苗的免疫原性、保护力和安全性，试验证明两种VP2亚单位疫苗免疫豚鼠很安全。现阶段疫苗的研发逐步向生产更安全的产品转化。亚单位疫苗具有许多优点，首要的便是可以彻底除去潜在病原体，避免疫苗产品中的潜在病原体反毒反强。亚单位疫苗主要是重组蛋白，因此可能会出现错误折叠或者不被免疫系统识别而导致免疫原性降低的现象，但是VLPs作为一种新型特殊的亚单位疫苗，是一种很复杂的灭活疫苗，VLPs不会出现免疫原性低的现象。VLPs的结构和真正的病毒粒子相似，并且不含有感染性核[63，80]酸物质，VLPs在诱导细胞免疫和体液免疫上较为高效。本试验所使用的佐剂是MontanideISA15AVG，它是一种基于矿物油设计的油佐剂，用于制备可注射的水包油包水型乳化疫苗，这种佐剂可使疫苗更稳定和易于注射，免疫试剂混合佐剂免疫机体，可提高疫苗的有效性。本试验中未观察到豚鼠机体发生佐剂不良反应。总之，VLPs免疫原性较好，免疫剂量较大的免疫试剂诱导产生的体液免疫水平较高。BEVS和pET表达系统表达的VP2作为亚单位疫苗免疫动物都比较安全。5.4.2淋巴细胞增殖试验T淋巴细胞在受到适当的刺激原刺激时转化成为淋巴母细胞，进一步转化成为致敏淋巴细胞，这一转化在一定程度上反映着机体的细胞免疫功能状态。MTT法主要是通过测定活细胞数量变化来反映淋巴细胞的增殖情况，该方法吸光度值的大小能够反映总淋巴细胞的活性，吸光度值越高，细胞活性越强。MTT法具有操作简便，不需要特殊仪器，不存在放射性污染等优点，但是该方法只能反映总淋巴细胞增殖情况，特异性较低。脾脏是机体内最大的外周免疫器官，具有贮血和免疫双重功能，是血液通路上病原体的滤过器官。中央动脉周围淋巴鞘主要含有T细胞、树突状细胞和少量巨噬细胞。淋巴滤39 泡分布于淋巴鞘内，主要由B细胞、少量滤泡组成。淋巴滤泡未受抗原刺激时，称为初级淋巴滤泡，接受抗原刺激后，可因B细胞增殖分化而出现生发中心，成为次级淋巴滤泡。在中央动脉周围淋巴鞘与血窦之间形成的边缘区中，富含B细胞、一定数量T细胞、少量[81]树突状细胞和巨噬细胞。本试验通过检测脾脏中的总淋巴细胞的活性来反应细胞免疫情况，虽然特异性不强，但是也能在一定程度上说明机体针对VP2的细胞免疫情况。除对照组外，其他各组都分别接种了不同成分，不同剂量的免疫试剂。PPV的衣壳蛋白VP2是一种主要保护性抗原，免疫后机体接触到VP2抗原，树突状细胞和巨噬细胞可作为抗原呈递细胞摄取、加工处理VP2抗原，然后再被具有相应抗原识别受体的T细胞识别结合后，刺激抗原特异性T细胞分化，一部分分化为效应T细胞，这种细胞能向外周炎症部位或者某些组织器官迁移发挥免疫作用，然后通过释放多种细胞因子和分泌细胞毒性物质，产生免疫效应和细胞毒作用；一部分分化为记忆T细胞，在再次接受相同抗原刺激后，可迅速活化，进而增殖分化为效应T细胞和新生记忆T细胞。本试验采用ConA对淋巴细胞进行刺激，刺激组与未刺激组相对比，各组中的刺激组的淋巴细胞都发生了不同程度的增殖。对照组为不免疫任何免疫试剂的免疫组，攻毒后，机体首次接触抗原，淋巴细胞被活化，因此受到刺激原刺激时，淋巴细胞发生增殖。但是对照组淋巴细胞增殖程度较其他免疫组的增殖幅度小。由于其他各组的豚鼠都分别接种两次免疫试剂，攻毒后免疫记忆发挥作用，因此有活性的淋巴细胞增多，经过刺激原刺激后增殖幅度较大。Ⅲ组和Ⅳ组的刺激组的淋巴细胞增殖水平整体高于其他免疫组，可能是由于VP2是主要的保护性抗原，并且BEVS表达的VLPs具有天然结构和功能，而PPV灭活疫苗在制作过程中可能破坏了一些抗原结构，pET表达系统表达的VP2由于在表达过程中缺乏有效地加工折叠，因此，Ⅲ组和Ⅳ组的免疫试剂中有效成分较多，更容易被树突状细胞和巨噬细胞识别处理呈递，VLPs诱导的细胞免疫反应更接近于天然PPV。5.4.3纳米PCR检测纳米PCR检测攻毒后一周各组豚鼠的内脏，结果表明各免疫组豚鼠内脏都未检出PPV，对照组的豚鼠的内脏中心脏、脾脏和肺脏检出PPV，这一结果说明三种免疫试剂对豚鼠机体都产生了免疫保护作用，即机体在受到PPV攻击时，机体内的免疫记忆细胞发挥作用，使得PPV被中和清除，没有在体内扩增繁殖。上述HI试验表明机体首次接触抗原，在一周之内所产生的抗体水平较低，并且有开始下降的趋势，因此在机体初次接触抗原时40 其可能还不具有控制病毒扩增繁殖的能力。对照组豚鼠在攻毒之前没有接触过任何相关抗原，在攻毒一周后机体首次接触抗原。心脏是机体的“泵”，全身各处的静脉血回流到心脏，由心脏泵入肺脏进行血液换气，携带氧气的动脉血再由心脏泵入动脉运往全身各处，心脏和肺脏大规模的接触到血液，如果血液中存在病毒，那么心脏和肺脏也会大规模接触到病毒，因此受病毒侵害机会较大。脾脏的主要功能是过滤和储存血液，同时脾脏是最大的免疫器官，当抗原呈递细胞捕获抗原后，会转移至淋巴器官，以刺激产生免疫反应。因此，如果血液中存在大量的PPV，病毒会在脾脏中聚集。以上分析可能是对照组豚鼠心脏、肺脏和脾脏检出PPV的原因。41 42 第六章结论第六章结论1、BEVS表达的VP2能够自我组装成VLPs，具有血凝活性，能够与PPV阳性血清发生特异性反应；2、pET表达系统表达的VP2不能自我组装成VLPs，不具有血凝活性，能够与PPV阳性血清发生特异性反应；3、成功构建高效的PPV纳米PCR检测方法；4、两种VP2亚单位疫苗免疫豚鼠均能够诱导产生体液免疫应答和细胞免疫应答，BEVS表达的VP2的免疫效果较好，适用于亚单位疫苗的研制。43 44 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附录常用试剂：（1）50×TAEBuffer：Na2EDTA·2H2O37.2g，Tris242g，用去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1mL醋酸充分混匀，最后定容至1L，使用时稀释成1×TAEBuffer。（2）IPTG（24mg/mL）：IPTG1.2g，用去离子水40mL溶解，再定容至50mL，用0.22μm滤膜过滤，-20℃保存。（3）LB液体培养基：NaCl10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，用去离子水溶解，调pH值至7.0，最后定容至1L，高压灭菌，室温冷却，4℃保存。（4）LB固体培养基：NaCl10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，固体琼脂15g，用去离子水溶解，调pH值至7.0，最后定容至1L，高压灭菌，室温冷却至60℃左右，加入1mL卡那霉素/氨苄霉素（100mg/mL），混匀，铺制平板，4℃保存。（5）PBSBuffer：NaC18.0g，KCl0.2g，Na2HPO41.42g，KH2PO40.27g，用800mL去离子水溶解，调pH值至7.4，加入去离子水定容至1L，高压灭菌，室温保存。SDS-PAGE用液配制：（1）1.5MTris（pH8.8）：Tris18.17g，用80mL去离子水溶解，用浓盐酸调pH值至8.8，加入去离子水定容至100mL。（2）1.0MTris（pH6.8）：Tris12.11g，用80mL去离子水溶解，用浓盐酸调pH值至6.8，加入去离子水定容至100mL。（3）10%SDS（W/V）：SDS10g溶解于100mL水中，室温保存。51 （4）10%过硫酸铵（W/V）：过硫酸铵0.1g，用1mL去离子水水溶解，4℃保存使用一周。（5）4%的浓缩胶：去离子水1.4mL，30%丙烯酰胺330μL，1.0MTris(pH6.8)250μL，10%SDS20μL，10%过硫酸铵20μL，TEMED2μL。（6）12%的分离胶：去离子水1.3mL，30%丙烯酰胺1.6mL，1.5MTris(pH8.8)1mL，10%SDS40μL，10%过硫酸铵40μL，TEMED2μL。（7）5×蛋白电泳缓冲液：Tris15.1g，Glycine94g，SDS5g，用800mL去离子水溶解，加入去离子水定容至1L。（8）5×SDS上样缓冲液：1.0MTris（pH6.8）1.5mL，SDS0.5g，BPB25mg，甘油2.5mL，加入去离子水定容至5mL，混匀后，-20℃保存。（9）0.1%考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-2501g，异丙醇250mL，冰醋酸100mL，加入去离子水650mL，搅拌均匀，用Whatman1号滤纸过滤，室温保存。Westernblot用液配制：（1）膜转移液：Glycine2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，加入去离子水定容至800mL，加入甲醇200mL，室温保存。（2）TBST：NaCl8.8g，1.0MTris（pH8.0）20mL，加入去离子水800mL，加入Tween200.5mL，加入去离子水定容至1L，4℃保存。（3）封闭液：脱脂乳5g，用TBST100mL溶解，4℃保存。Grace昆虫细胞培养基：Grace粉末（1L规格），加入去离子水800mL，加入NaHCO30.35g，调PH值至6.0-6.2，加入水解乳蛋白0.33g，酵母提取物3.3g，加入去离子水定容至1L，用0.22μm滤膜过滤。52 蛋白纯化所需试剂：（1）1×Ni-NTA结合缓冲液:NaH2PO43.94025g，NaCl8.766g，咪唑0.3404g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至8.0，加入去离子水定容至500mL。（2）1×Ni-NTA漂洗缓冲液：NaH2PO43.94025g，NaCl8.766g，咪唑0.6808g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至8.0，加入去离子水定容至500mL。（3）1×Ni-NTA洗脱缓冲液：NaH2PO43.94025g，NaCl8.766g，咪唑8.51g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至8.0，加入去离子水定容至500mL。（4）BufferB：尿素240.24g，NaH2PO47.8005g，Tris0.6057g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至8.0，加入去离子水定容至500mL。（5）C缓冲液：尿素240.24g，NaH2PO47.8005g，Tris0.6057g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至6.3，加入去离子水定容至500mL。（6）D缓冲液：尿素240.24g，NaH2PO47.8005g，Tris0.6057g，加入去离子水400mL，充分混匀后，调PH值至5.9，加入去离子水定容至500mL。（7）E缓冲液：尿素240.24g，NaH2PO47.8005g，Tris0.6057g，加入去离子水400mL，充分混匀后，分别调PH值至4.5，4.4，4.3，4.2，4.1和4.0，加入去离子水定容至500mL。53 54 致谢光阴似箭，三年的美好时光里我收获了许多：知识，友爱，感恩。衷心感谢我的导师崔尚金研究员对我的试验和论文所给予的支持与帮助，衷心感谢王春仁老师在我的学习和生活中所给予的关心与照顾，衷心感谢崔玉东教授对我的论文的指导与建议。三位恩师知识渊博、治学态度严谨，他们给予我殷切的教导和和无私的帮助，使我增长了知识，顺利完成毕业论文和课业知识，也让我明白学无止境，更上一层楼的道理。三位恩师胸怀宽大、积极认真，是我学习的楷模和不断前进的动力。感谢黑龙江八一农垦大学动物科技学院杨焕民院长、武瑞书记，衷心的感谢倪宏波老师、于丽芸老师、侯喜林老师、杨玉英老师、冉旭华老师、邵红老师等在我的学习和生活上的帮助！感谢哈尔滨兽医研究所课题组仇铮老师、马兴杰硕士、王朝硕士、胡峰博士、刘朝霞硕士、张晶老师、张炳坤老师、王晓玲硕士、孔苗苗硕士和陆海良师傅等在我的试验和生活中给予莫大的支持和无私的帮助。向中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的领导和老师们致以衷心的感谢！感谢研究生处范文艳处长、陈蕊老师、王喆老师、李冬野老师在研究生学习期间给予我的无私帮助。感谢我的父亲、母亲在我的求学之路上给予的莫大的关心与支持，父母的支持与照顾是我求学的最大动力，我一定铭记父母的恩情，努力将自己所学学以致用，以报答父母的养育深恩。感谢和我一起奋斗的朋友田思勤、郑旭、娄艳、衣菲、黄艳秋、陈淑慧、孙超、张雪云等在试验上给予我的无私帮助。真诚地感谢百忙之中评阅我的论文的专家和学者。最后，我再次向一直以来给予我关心、支持和帮助的老师、同学及亲朋好友们致以深深的敬意!55 56 作者简历个人情况姓名：崔宇超性别：女民族：汉族籍贯：黑龙江齐齐哈尔出生年月：1987.06婚姻状况：未婚教育背景2006.09-2011.07东北农业大学动物医学学院动物医学专业，农学学士2011.09-2014.07黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学专业，农学硕士基金项目国家自然科学基金(31001069、31172349、31172341)在研期间发表的论文CuiY,WangZ,MaX,etal.Asensitiveandspecificnanoparticle-assistedPCRassayforrapiddetectionofporcineparvovirus[J].LettApplMicrobiol,2013,58:163-167.崔宇超，彭永刚，马兴杰等.猪细小病毒高效纳米PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2014,36(4):286-288.57