猪细小病毒vp2蛋白亲和肽筛选和鉴定

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1、摘要猪细小病毒是引起猪繁殖障碍的重要病原之一，该病广泛存在于世界各地并在大多数猪场流行，给养猪业带来巨大的损失，因此猪细小病毒一直是猪病研究的热点之一。VP2蛋白是PPV病毒粒子的主要衣壳蛋白，能刺激机体产生抗PPV中和抗体，且基因序列保守，其表达的蛋白具有较强的免疫原性，故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有重要价值。一。本研究根据GenBank发表的PPVBQ株的基因序列，设计一对引物，通过PCR扩增得到VP2基因片段，长度为1740bp。酶切后插入原核表达载体pET32a(+)的T7启动子下游，构建的重组质粒VP2．pET32a经IPTG诱导，在

2、E．coliRosetta中进行高效表达。SDS-PAGE结果显示，表达产物分子量为82KDa，与预期大小一致，主要以包涵体的形式存在。Westernblot显示，该蛋白能与感染PPV猪的阳性血清发生特异性反应，说明该重组蛋白具有抗原性，可以作为鉴别诊断用抗原。噬菌体展示技术是一种靶蛋白配体筛选方法。本试验以VP2蛋白为靶分子，利用噬菌体随机十二肽库，对VP2重组蛋白进行了五轮生物淘选。在第四轮筛选表达载体pET32a(+)的标签蛋白，从第五轮洗脱物噬菌斑中随机挑取10个单克隆菌落，进行核酸序列的测定及多肽序列的推导，其结果表明，对靶分子经过5轮筛选后，最终筛选出6种

3、亲和力的十二肽。将亲和力最高和重复性最好的2个序列进行合成，分别为1号肽：HTHQLHFLNHNP；2号肽：HNLHLYHYLRSA。通过MTT法和免疫荧光试验检测合成肽体外抗病毒活性，其结果显示PPV和肽孵育1h后同步加入ST细胞这种方式有抑制病毒的作用，2号肽具有良好的生物学活性，对病毒的抑制率远高于l号肽，1号肽抑制病毒的能力较弱，但二者混合后抑制能力增强。本研究为寻找PPV受体奠定了基础，为今后对PPV的防治及多肽疫苗的研制开发提供了一定的理论基础和试验依据。关键词PPV；VP2蛋白；VP2多克隆抗体；噬菌体技术；肽活性鉴定AbstractScreeninga

4、ndIdentificationofAffinityPeptidestoVP2ProteinofPorcineParvovirusVirusPorcineparvovirus(PPV)causesreproductivefailureinswine，ThevirusisubiquitousamongswinethroughouttheworldandiSenzooticinmostherdsthathavebeentested．TheVP2proteinofPPVisamajorstructuralproteinofvirusandhasspecificimmunog

5、enicity．TheVP2geneisaconservedsequenceintheviralgenome．Theexpressedproductwouldbeusedindiagnosis．AccordingtotheVP2genesequenceofPPVstrainBQpublishedinGenBank,apairofprimersWaSusedtoamplifytheVP2genebyPCR．TheVP2consistsof1740bpinlength．VP2wasdigestedBamHIandSa／Itheninsertedintothedownstr

6、eamofT7promoterofprokaryoticexpressionvectorpET32a(+)toconstructanexpressionplasmidVP2-pET32a．AfterinductionbyIPTG，thefusionproteinwashighlyexpressedinEscherichiaColiRosseta(DE3)intheformofinclusionbodies．SDS—PAGEindicatesthattheVP2proteinisapproximately82KDaasexpected．Westernblotindica

7、testhattheproteinCallberecognizedbyswineanti-PPVserum．AllresultsindicatedthattherecombinantfusionproteincanbeusedasanantigenofdiagnosticassaytodetectthePPVantibodyinserum．Phagedisplayisatechnologyforligandidentificationtotargetprotein．Inthisstudy，Random12-metPhageDisplayPeptide