猪细小病毒1型vp2蛋白与猪圆环病毒2型cap蛋白共表达产物免疫原性鉴定

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1、*密级:论文编号:中国农业科学院学位论文猪细小病毒1型VP2蛋白与猪圆环病毒2型Cap蛋白共表达产物免疫原性鉴定ImmunogenicityIdentificationofCo-expressedPorcineParvovirusType1VP2proteinandPorcineCircovirustype2CapProtein硕士研究生：孙建慧指导教师：刘长明研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgricultural

2、SciencesDissertationImmunogenicityIdentificationofCo-expressedPorcineParvovirusType1VP2proteinandPorcineCircovirustype2CapProteinM.S.Candidate：SunJian-huiSupervisor：Prof.LiuChang-mingMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologyChineseAcademyof

3、AgriculturalSciencesMay2015摘要猪圆环病毒2型（PCV2）是临床中诱发断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，常与猪细小病毒1型（PPV1）发生混合感染而导致更为严重的PMWS临床症状和组织病理损伤，给世界养猪业带来了巨大的经济损失。近年来，国内关于PCV2与PPV1混合感染的报道较多，引起了广泛关注。通过对临床中PPV1、新型猪细小病毒（PPV2、PPV3、PPV4）与PCV2的混合感染情况进行了流行病学调查，对其流行毒株进行了遗传变异分析，为我国PPVs和PCV2的综合防治提供科学依据。鉴于我国猪群中二者存在混合感染现象，因

4、而开发针对PCV2和PPV1的二联亚单位疫苗具有重要的临床应用价值。PCV2-Cap蛋白和PPV1-VP2蛋白分别是PCV2和PPV1的主要结构蛋白，在诱导机体特异性免疫反应中发挥重要作用，是亚单位疫苗制备的重要候选抗原。本研究以杆状病毒系统表达PPV1-VP2蛋白制备单克隆抗体，为亚单位疫苗制备中VP2蛋白的表达提供检测手段；采用杆状病毒双表达系统共表达PPV1-VP2蛋白与PCV2-Cap蛋白，经动物免疫试验鉴定其免疫原性，为亚单位疫苗的研制提供了技术支撑。为了解新型猪细小病毒（PPV2、PPV3和PPV4）与PMWS发生之间的关系，本研究对疑似PCVAD病

5、料进行了PPV1、PPV2、PPV3、PPV4与PCV2的混合感染调查及分子流行病学分析，为PMWS的致病机理的研究提供新的思路。流行病学调查表明，PPVs与PCV2单独感染阳性检测率分别为：5.56%（PPV1）、39.56%（PPV2）、45.11%（PPV3）、21.56%（PPV4）和47.33%（PCV2）；PPVs与PCV2的混合感染阳性检测率分别为：4%（PPV1+PCV2）、22.44%（PPV2+PCV2）、24%（PPV3+PCV2）和12%（PPV4+PCV2）。选取其中PPVs和PCV2阳性样品对病毒主要结构蛋白编码基因进行了遗传进化分析

6、与氨基酸序列比对。结果表明，PPVs与PCV2在遗传进化上主要形成2大分支；通过氨基酸序列比对分析找到了一些可能影响PPVs与PCV2遗传进化的关键氨基酸位点。鉴于新型PPVs与PCV2混合感染情况较为严重，因而推测二者在PMWS的发生中起到了相互促进作用，这为PMWS疾病模型的研究提供一定线索。为了建立PPV1抗原检测方法，以重组杆状病毒表达PPV1-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠，融合后采用IPMA方法筛选获得了8株针对PPV1-VP2蛋白的单克隆抗体。结果表明，所制备的单抗均可与PPV1感染的ST细胞呈阳性反应且可以与自然PPV1-VP2蛋白产生良好的免疫

7、反应。为了鉴定这些单抗所针对的抗原表位，我们将PPV1-VP2蛋白依次进行了分段截短表达与两端截短表达，并通过间接ELISA的方法来扫描多肽与单抗的反应特性，从而确定单抗表位的最短核心228233序列。结果表明，这8株单抗总共针对3个VP2表位，分别为B5-E1（QQITDA）、B10-E2284291344356（RSLGLPPK）与B15-E3（FEYSNGGPFLTPI）。PPV1-VP2氨基酸序列比对结果表明，B10-E2与B15-E3在29条比对序列中完全保守，而B5-E1在233位氨基酸发生碱基替换。以其中1株单抗（8E4）作为检测抗体，通过间接EL

8、ISA方法，对重组杆状病