特发性肺纤维化疾病中氧化应激反应对肺泡干细胞功能的调控

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分类号：R56学校代码：10062密级：学号：2015602362硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：特发性肺纤维化疾病中氧化应激反应对肺泡干细胞功能的调控TITLE：TheregulationofalveolarstemcellsbyoxidateivestressinIdiopathicPulmonaryFibrosis一级学科：临床医学二级学科：内科学呼吸系病论文作者：刘会金指导教师：吴琦教授天津医科大学研究生院二〇一八年五月 分类号：R56学校代码：10062密级：学号：2015602362学位类别：科学学位专业学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：特发性肺纤维化疾病中氧化应激反应对肺泡干细胞功能的调控TITLE：TheregulationofalveolarstemcellsbyoxidateivestressinIdiopathicPulmonaryFibrosis一级学科：临床医学二级学科：内科学呼吸系病论文作者：刘会金指导教师：吴琦教授导师组成员：陈怀永天津医科大学研究生院二〇一八年五月 学位论文原创性声明．本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研宄成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果一，与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名＂：日期：＞？年５月日１１学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书》｜□本论文属于不保密［３。“”（请在相对应的方框内打ｖ）Ｉ学位论文作者签名：日期：２Ｐ搖年Ｓ月１日导师签名：／曰期：以尽年ｒ月１日ａ＼ 天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：肺脏的功能主要是通气功能与换气功能，通气功能是肺与外界空气的吸入与呼出功能，换气功能主要是在肺组织内部肺泡与血液之间的气体交换。在成人肺中，有超过40种细胞，肺上皮细胞覆盖于呼吸道表面，不同部位的呼吸道有不同类型的上皮细胞。其中1型肺泡上皮细胞（Alveolartype1,AT1）和2型肺泡上皮细胞（Alveolartype2,AT2）分布在肺泡区域。AT2细胞具有多种功能。首先AT2细胞能够分泌多种肺泡表面活性物质，这些肺泡表面活性物质可以降低肺泡表面张力，增加肺顺应性功能，还具有抗氧化和抗菌作用。另外，在肺组织更新及修复过程中，AT2细胞可以再生生成新的AT2细胞，也可以分化为AT1，因此被看做是肺泡上皮黏膜的干细胞。在特发性肺纤维化（Iidopathicpulmonaryfibrosis,IPF）中，肺组织损伤是典型的病理学特征，但是病理学机制未完全被揭示。本研究利用博莱霉素（Bleomycin,BLM）诱导的IPF小鼠模型发现，损伤后的肺泡产生氧化应激反应，小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢浓度显著升高。利用干细胞体外培养模型研究发现，过氧化氢抑制AT2细胞的增殖与分化，揭示了IPF患者肺泡上皮黏膜损伤的机制。目前对氧化应激反应在肺泡干细胞功能的调控没有相关报道，我们利用疾病动物模型和细胞生物学等手段，本研究的初步结果，为特发性肺纤维化疾病的治疗提供新的思路。方法：1、建立BLM诱导的小鼠纤维化模型，H&E染色和masson染色观察小鼠肺纤维化病理改变；2、测定BLM造模后小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢含量；3、利用流式细胞技术提取AT2细胞，3D培养观察AT2细胞的增殖分化功能；4、体外3D培养2型肺泡上皮细胞，对照组只加入基础培养基，实验组加入1mMH2O2，分析AT2细胞与增殖分化功能。提取细胞RNA，应用实时定量PCR方法（qRT-PCR）测定相关基因表达量。结果：1、BLM诱导的小鼠纤维化模型中，肺泡上皮受损，AT2细胞增殖能力明显下降。2、BLM诱导的小鼠肺纤维化中，小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢浓度明显升高。3、过氧化氢刺激AT2细胞，导致AT2细胞的增殖与分化功能下降。结论：BLM诱导的小鼠肺纤维化中，氧化应激反应抑制了AT2细胞的增殖分化I 天津医科大学硕士学位论文能力，从再生医学角度揭示了IPF患者肺泡上皮损伤的病理学机制。关键词：氧化应激2型肺泡上皮细胞细胞增殖细胞分化肺纤维化II 天津医科大学硕士学位论文AbstractObjective:Themainfunctionofthelungistheventilationandgasexchange.Theventilationincludestheinhalationandexhalationbetweenthelungandtheoutsideair.Thegasexchangeoccursbetweenthealveolarsurfaceandthebloodvesselsinsidethelungtissue.Intheadultlung,therearemorethan40typesofcells.Thelungepithelialcellscoverthesurfaceoftherespiratorytract,anddifferentpartsoftherespiratorytracthavedifferenttypesofepithelialcells.Type1alveolarepithelialcells(AT1)andtype2alveolarepithelialcells(AT2)locatesinalveolarspace.Type2alveolarepithelialcellshavemultiplefunctions.Firstofall,theyarecapableofsecretingavarietyofalveolarsurfactants.Thesealveolarsurfactantscanreducealveolarsurfacetensionandincreaselungcompliance.Theyalsohaveantioxidantandantibacterialeffects.Inthecourseoflungtissuerenewalandrepair,type2alveolarepithelialcellscanregeneratenewtype2alveolarepithelialcells,andtheycanalsodifferentiateintotype1alveolarepithelialcells.AT2cells,therefore,areconsideredtobestemcellsofalveolarepithelium.Inidiopathicpulmonaryfibrosis(IPF),alveolarepitheliumisdemonstratedtobeseverelydamaged.Howver,theunderlyingmechanismremainsunexplored.Inpresentstudy,weobservedthatoxidativestressoccursinlungsofbleomycin-induceinjury.Hydrogenperoxideconcentrationincreasesinlunglavage.WelaterculturedAT2inpresenceofH2O2toexaminethepossibleroleofH2O2inregultaitonofAT2cells.WefoundthatH2O2decreasesbothproliferationanddifferentiationofAT2cells.ThispreliminarydataprovideapieceofevidencetorevealpathologicalmechanismofalveolarepithelialdamageoccuredinIPF.Method:1.EstablishmentofBLM-inducedmousefibrosismodel,H&Estainingandmassonstainingtoobservepathologicalchangesofpulmonaryfibrosisinmice.2.DeterminationofHydrogenPeroxideinMouseBronchialLavageFluidAfterBLMModeling.3.UsingflowcytometrytoextractAT2cells,3DculturetoobservetheproliferationanddifferentiationofAT2cellsIII 天津医科大学硕士学位论文4.Invitro3Dculturetype2alveolarepithelialcells,thecontrolgrouponlyaddedbasicmedium,theexperimentalgroupwasadded1mMH2O2,analysisproliferationanddifferentiationofAT2cells.RNAwasextractedfromthecellsandreal-timequantitativePCR(qRT-PCR)wasusedtodeterminetheexpressionlevelofrelatedgenes.Result:1.InBLM-inducedmousefibrosismodel,alveolarepitheliumwasimpairedandAT2cellproliferationwassignificantlydecreased.2.BLM-inducedlungfibrosisinmice,theconcentrationofhydrogenperoxideinthemousebronchiallavagefluidsignificantlyincreased.3.HydrogenperoxidestimulatedAT2cells,resultingindecreasedproliferationanddifferentiationofAT2cell.Conclusion:OxidativestressinhibitstheproliferationanddifferentiationofAT2cellsinBLM-inducedlungfibrosisinmice.ThepathologicalmechanismofalveolarepithelialdamageinpatientswithIPFwasrevealedfromaperspectiveofregenerativemedicine.Keyword：oxidativestress,type2alveolarepithelialcells,cellproliferation,celldifferentiation,pulmonaryfibrosisIV 天津医科大学硕士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………………………ⅠAbstract……………………………………………………………………………Ⅲ缩略语/符号说明…………………………………………………………………Ⅶ前言…………………………………………………………………………………1研究现状、成果…………………………………………………………………1研究目的、方法…………………………………………………………………3一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变…………………………41.1对象和方法…………………………………………………………………41.1.1实验对象………………………………………………………………41.1.2实验方法………………………………………………………………41.2结果…………………………………………………………………………81.2.1BLM诱导的小鼠肺损伤病理学分析……………………………………81.2.2BLM诱导的小鼠肺损伤中肺泡干细胞功能低下……………………101.3讨论…………………………………………………………………………121.4小结…………………………………………………………………………12二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能…………………………………………132.1对象和方法…………………………………………………………………132.1.1实验对象………………………………………………………………132.1.2实验方法………………………………………………………………132.2结果…………………………………………………………………………162.2.1肺纤维化小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢浓度升高………………………162.2.2过氧化氢抑制肺泡干细胞增殖…………………………………………162.2.3过氧化氢抑制肺泡干细胞分化………………………………………192.3讨论…………………………………………………………………………202.4小结…………………………………………………………………………21结论…………………………………………………………………………………22参考文献……………………………………………………………………………23综述…………………………………………………………………………………27V 天津医科大学硕士学位论文肺纤维化与干细胞移植…………………………………………………………32综述参考文献……………………………………………………………………34致谢…………………………………………………………………………………35个人简历……………………………………………………………………………37VI 天津医科大学硕士学位论文缩略语/符号说明英文符号英文全称中文全称AT1TypeIalveolarepithelialcellⅠ型肺泡细胞AT2TypeIIalveolarepithelialcellⅡ型肺泡细胞BASAlbuminfrombovineserum胎牛血清白蛋白BCsbasalcells基底细胞BLMBleomycin博莱霉素CCSPClaracellsecretoryproteinClara细胞分泌蛋白DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸ECMextracellularmatrix细胞外基质EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EGFEpidermalgrowthfactor表皮生长因子EGFREpithelialgrowthfactorreceptor表皮生长因子受体EpiSPCairwayepithelialstem/progenitorcell肺泡上皮先祖/干细胞FBSfetalcalfserum胎牛血清FCMflowcytometry流式细胞术GFPgreenfluorescentprotein绿色荧光蛋白GSHglutathione还原型谷胱甘肽H2O2HydrogenPeroxide过氧化氢HBSSHank'sBalancedSaltSolutionHank's平衡盐溶液IPFIdiopathicpulmonaryfibrosis特发性肺纤维化MSCMesenchymalstemcells间充质干细胞NACN-Acetyl-L-cysteineN-乙酰半胱氨酸PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应qRT-PCRquantitativereversetranscriptase实时定量聚合酶链反应polymerasechainreactionRT-PCRReverseTranscription-PCR逆转录聚合酶链反应RNARibonucleicAcid核糖核酸SPCSurfactantapoproteinPoretinC肺泡表面张力蛋白CVII 天津医科大学硕士学位论文英文符号英文全称中文全称TGFtransforminggrowthfactor转化生长因子VIII 天津医科大学硕士学位论文前言研究现状、成果肺泡上皮是实现肺表面气体交换的部位。目前临床研究发现，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、闭塞性细支气管炎在内的多种肺部疾病的发生与肺泡上皮破损紧密相关[1]。特发性肺纤维化是最常见的一种间质性肺疾病，表现为呼吸困难，伴有刺激性干咳，病情呈持续性进展，最终导致呼吸衰竭而死亡。发病率约3-5/10万，占所有间质性肺病的65%左右，临床缺乏有效的治疗手段和治疗药物[2]。研究表明肺泡上皮破损是特发性肺纤维化发生发展过程的关键因素[3]。因此，进一步对肺泡上皮损伤修复机制的研究将有助于我们找到针对性的治疗该疾病的方法。肺泡上皮黏膜主要由1型肺泡上皮细胞（Alvoelartype1cells,AT1）和2型肺泡上皮细胞（Alvoelartype2cells,AT2）组成。AT1细胞和AT2细胞彼此连接紧密，形成一个完整的屏障，完成肺表面气体交换的同时阻止外来物质入侵。当机体受到外界剌激，肺泡上皮细胞出现损伤，屏障的完整性遭到破坏，导致肺表面气体交换功能降低，外源物质入侵打乱肺内稳态，引起炎症反应，肺泡结构塌陷等器质性病变。因此，完整的肺泡上皮结构对肺功能的实现非常重要。AT2细胞被认为是肺泡上皮的干细胞。AT2细胞既可以自我更新为新生成的AT2细胞，也可以分化为AT1细胞，在维持肺泡上皮结构的完整性和功能中发挥重要作用[4]。在肺泡上皮损伤时，AT2细胞可分化为AT1细胞来修复损伤的肺泡上皮。在体外传代培养细胞中，AT2细胞也可失去自身特征并获得AT1细胞的特征。相关研究表明，在博莱霉素(bleomycin，BLM）诱导的小鼠肺泡上皮损伤模型中，AT2细胞增殖并分化为AT1细胞，试图恢复肺泡屏障的损伤[4]。把AT2细胞移植到BLM损伤的小鼠肺中,可以显著减轻肺泡损伤[5]。AT2细胞功能异常时修复能力下降,引起小鼠死亡[6]。这些研究说明，AT2细胞增殖分化与肺上皮损伤修复有着密切关系。因此，肺泡干细胞AT2常作为目标细胞来研究肺泡损伤与修复[7]。AT2细胞的增殖与分化过程中有很多信号通路参与。如在体外培养肺上皮干细胞时加入TGF受体抑制剂SB431542可增加肺上皮干细胞克隆形成率，提示TGF信号抑制上皮干细胞增殖[8]。阻断Wnt/β-catenin通路，能减轻BLM1 天津医科大学硕士学位论文诱导AT2细胞的损伤[9-10]。相反，过度激活该通路，又能促使AT2细胞纤维化[11]。TGF实际上是通过调控肺间质细胞的分泌，间接调控AT2细胞的再生能力[12]。最近的研究表明，TSP1/CD36在肺泡上皮再生中发挥重要作用[13]。EGF信号在体外能剌激AT2细胞的增殖，而EGFR阻断剂能抑制AT2细胞增殖，说明EGF是调控AT2细胞增殖的重要细胞因子[14]。另外，原癌基因KrasG12D能促进AT2细胞增殖[14]，PTEN基因缺失也可以促进肺泡干细胞增殖[15]。由于肺与外界气体的相通，引起肺泡上皮黏膜的损伤有多种因素，譬如吸入的微生物或大气污染颗粒等[16-17]。所有这些都会不同程度的引起肺泡产生应激反应。肺泡上皮黏膜的损伤是氧化应激反应的源头，损伤后得不到及时的修复则会加重氧化应激反应。虽然IPF的病因不明，但是病理学分析提示IPF病人肺泡区域有明显氧化应激反应[18]。氧化应激引起的组织损伤在小肠、肝脏和肾脏等很多组织器官中都已经被证实[19-21]。人们也认为IPF的病程与肺泡氧化应激反应有关。氧化应激可能释放TGF等多种细胞因子，在肺上皮细胞损伤后促进成纤维细胞的转化与增殖[22]。如果能恢复肺泡上皮细胞黏膜的完整，则可以止住氧化应激反应带来的组织损伤和纤维化进展，人们尝试了多种干细胞治疗措施[23-24]。但是，最好的方案是利用肺泡区域的干细胞，再生修复损伤的肺泡上皮，毕竟这是肺泡再生的最直接动力。在这之前需要知道的是在IPF中，肺泡上皮再生能力是否下降，氧化应激反应是否影响了肺泡上皮黏膜再生等一系列问题。但是对于这些问题的研究有利于揭示IPF肺泡氧化应激反应的发生与损伤作用，为以后的药物开发提供新的药物靶标。综合上述国内外研究现状，我们拟定以下几个问题：在肺损伤病理过程中肺泡上皮干细胞的功能有无改变？氧化应激对AT2细胞的增殖、分化功能起到了什么作用？这些问题亟待揭示。2 天津医科大学硕士学位论文研究目的、方法研究目的建立Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型，后收集肺组织，分析肺病理学改变确认造模成功。收集造模成功的小鼠肺泡灌洗液，测定H2O2浓度，明确肺纤维化小鼠中肺泡灌洗液中H2O2浓度升高。用1mMH2O2去刺激肺泡上皮细胞，观察AT2细胞的增殖分化能力。研究方法1、建立BLM诱导的小鼠纤维化模型，H&E染色和masson染色观察小鼠肺纤维化病理改变；2、测定BLM造模后小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢含量；3、利用流式细胞技术提取AT2细胞，3D培养观察AT2细胞的增殖分化功能；4、体外3D培养2型肺泡上皮细胞，对照组只加入基础培养基，实验组加入1mMH2O2，分析AT2细胞与增殖分化功能。提取细胞RNA，应用实时定量PCR方法（qRT-PCR）测定相关基因表达量。3 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变建立Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型，后收集肺组织，分析肺病理学改变确认造模成功。随后分选肺泡干细胞并进行体外3-D培养，考查肺损伤中肺泡干细胞功能的变化。由此可以判断IPF中肺泡再生能力是否下降。1.1对象和方法1.1.1实验对象（1）C57BL/6小鼠：饲养于SPF级环境，健康小鼠体重18-25g，8-12周龄。实验小鼠由天津市海河医院基础医学实验部SPF级动物饲养屏障〈许可证号：SYXK（津）20160002）。1.1.2实验方法主要实验试剂主要实验试剂（1）7.5%水合氯醛溶液，BBI公司；（2）0.9%生理盐水，上海生工公司；（3）磷酸盐缓冲溶液（PBS，10X)，Gibco公司；（4）胰酶（EDTA-四乙酸二氨基乙烷），Hyclone公司；（5）DMEM（dulbecco’smodifiedeaglemedium）培养基，Gibco公司；（6）Trizol，Invitrogen公司；（7）EGTA，Hyclone公司；（8）Ham'sF-12培养基，Cellgro公司；（9）FBS-胎牛血清，Gibco公司；（10）DEPC水，solarbio公司；（11）乙醇（无水），上海生工公司；（12）盐酸，上海生工公司；（13）氢氧化钠，上海生工公司；（14）乙醇（75%），上海生工公司（15）DNAseI，Sigma公司；（16）红细胞裂解缓冲液（RBClysisbuffer），Sigma公司；（17）Elastase（弹性蛋白酶），WorthingtonBiochemicalCorporation公司；4 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变（18）StreptavidinAPC-eFluor780，eBioscience公司；（19）HEPES缓冲液，Sigma公司；（20）HBSS，Sigma公司（21）台盼蓝溶液，上海生工公司；(22)博莱霉素，日本公司主要实验耗材及仪器（1）荧光倒置显微镜，奥林巴斯公司；（2）相差倒置显微镜，奥林巴斯公司；（3）显微镜，奥林巴斯公司；（4）超纯水机，Millpore公司；（5）器械清洗机，白象科技公司；（6）-80℃低温冰箱，赛墨飞公司；（7）药品箱，赛墨飞公司；（8）离心机，赛墨飞公司；（9）-25℃低温冰箱，赛墨飞公司；（10）液氮罐，MVE公司，；（11）生物安全柜，NUAIRE公司；（12）流式分选细胞仪，BD公司；（13）CO2培养箱，NUAIRE公司；（14）冷冻离心机，赛墨飞公司；（15）恒温水浴箱，精骐公司；（16）制冰机，雪科公司；（17）吸液器-电动，梅特勒公司；1.1.2.1博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型（1）水合氯醛麻醉小鼠，称量体重并做记录；（2）将小鼠固定在手术台上,酒精消毒颈部,剪开颈部皮肤,暴露气管；（3）用1毫升注射器将博莱霉素注射到气管，继续注入0.lmL的空气，对照组注射等量PBS；（4）注射后将动物置于头向上正立位，并向左向右转动，使药在肺内均匀灌注，随后立即缝合颈部切口。观察2周。1.1.2.2收集肺组织并进行H&E病理染色5 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变（1）7.5%水合氯醛麻醉上述经博莱霉素诱导的小鼠。并固定于操作板上；（2）70％的酒精喷撒小鼠消毒，依次剪开小鼠皮肤、筋膜和腹肌；（3）剪断肠系膜动脉，使小鼠失血，后用纱布吸尽腹腔血液，充分暴露视野；（4）剪开小鼠横膈膜，使肺放气；（5）分离小鼠主气管周围肌肉和组织，擦拭周围血液，充分暴露气管；（6）施行气管插管，注意不要插管太深，以免插入左右主支气管或肺组织，后丝线打结，固定；（7）剪开左侧胸腔，注意不要碰触肺组织，并剪断左侧锁骨；（8）取出肺组织，经气管插管于福尔马林下持续冲洗；（9）福尔马林固定后进行不同浓度脱水酒精脱水；（10）使石蜡进入脱水后的肺组织中，后置于融化状态的固体石蜡中，待凝固成蜡块；（11）在切片机上把蜡块切成约5μm的厚度，并进行烤片和脱蜡。（12）行苏木素（H&E）染色（13）将经H&E染色的切片置于显微镜下观察。1.1.2.3Masson染色检测BLM诱导小鼠肺纤维化胶原形成操作原理：Masson染色主要使结缔组织染色，以与非结缔组织区分，在此实验中胶原纤维会被染成蓝色，以明确BLM诱导小鼠肺纤维化模型造模是否成功。（1）切片脱蜡处理；（2）在切片上滴100μl试剂A（Masson复合染色液)，时间约为5分钟。在蒸馏水中涮去染色液；（3）同样滴100μl试剂C，染色时间为5分钟，甩干；（4）同样滴100μl试剂D，染色时间为5分钟，用蒸馏水稍微冲洗；（5）滴100μl试剂B，分化时间为45秒，并重复分化一次；（6）酒精脱水，封闭固定切片；（7）置于显微镜下观察。1.1.2.4BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能分析1）干细胞分选（1）7.5%水合氯醛麻醉小鼠。并固定于操作板上；6 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变（2）70％的酒精喷撒小鼠消毒，依次剪开小鼠皮肤、筋膜和腹肌；（3）剪断肠系膜动脉，使小鼠失血，后用纱布吸尽腹腔血液，充分暴露视野；（4）剪开小鼠横膈膜，使肺放气；（5）分离小鼠主气管周围肌肉和组织，擦拭周围血液，充分暴露气管；（6）施行气管插管，注意不要插管太深，以免插入左右主支气管或肺组织，后丝线打结，固定；（7）剪开左侧胸腔，注意不要碰触肺组织，并剪断左侧锁骨；（8）用5ml灌满1×PBS的注射器心脏灌流三次，肺变白表示成功；（9）收集肺组织：在插管以上部位剪断气管，小心离断肺与周围组织的连接，注意不要损伤肺，保持肺脏的完整性；（10）对气管插管进行标号，把取下的整块组织放入盛有PBS的锥形管中；（11）把锥形管放置于冰上。（12）用特定酶处理肺块6次，每1次时长5min；（13）后取出组织，剪刀弃去心脏，保留肺组织；（14）在培养皿中剪碎肺块，至约2mm2大小，后换用手持美国进口刀碎肺，最终使肺碎成呈糊状，以看不到颗粒为准；（15）加入DNA酶在37℃恒温箱静置15min；（16）拿出培养皿，注进HBSS/2%FBS，尽量充分吹打消化过的肺组织；（17）将肺组织通过70um滤膜转到50ml管中，离心，转速为600转/每分钟，5min离心；（18）弃上清。用“racking”方式振荡分散管底细胞；（19）加入1ml红细胞裂解液，吹打混合沉淀，使细胞重新悬浮，冰上静置1.5min，不要静置太长时间，以免肺泡上皮细胞被裂解；（20）继续注入20mlHBSS/2%FBS终止反应，后置于离心机中，7000转/每分钟，5min，弃上清；（21）用“racking”方式振荡分散管底细胞；注入1mlHBSS/2%FBS，吹打混匀，重新悬浮细胞，待用。（22）分别在单色补偿管、样本管、空白对照管中加入上面取得的细胞悬液；（23）单色补偿管加入APC-Sca1、PE-Cy7-Epcam、7AAD、Biotin-CD45；样本管加入APC-Sca1、PE-Cy7-Epcam、Biotin-CD31、Biotin-CD45、Biotin-CD34；于冰上静置45min，注意避光；7 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变（24）注入HBSS/2%FBS，配平后置于离心机中7000转/每分钟、5min，倒掉上清液；（25）注入HBSS/2%FBS，吹打，使沉淀中细胞重新悬浮；（26）于冰盒上把荧光抗体加入上述试管中，静置时间为40min；（27）注入缓冲液，配平后置于离心机中，7000转/每分钟、离心5min后弃去上清。（28）注入缓冲液，吹打，使沉淀中细胞重新悬浮；（29）把7AAD加入样本管中，静置，时间为15min；（30）经70um滤网逐个过滤上述各管细胞，经FCM分选，得到AT2细胞。2）干细胞培养分选得2型肺泡上皮细胞与肺成纤维细胞混合均匀，注入Matrigel胶继续混合均匀后，一起注于24孔板小室（GreinerBio-One）中，后放于37℃恒温培养箱30min，另Matrigel胶凝固。培养基均为PBS.隔一天换一次培养基。3）增殖分析培养10天后，在显微镜下观察AT2细胞的克隆及直径，对克隆进行计数，计数标准为：克隆直径>100um的记为1个克隆，计算两组样本中AT2细胞克隆形成率（每100个细胞中克隆形成量）。*表示p<0.05，**代表p<0.01。1.2结果1.2.11)在Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型中，与对照组（注射PBS组）相比，BLM处理组中肺泡区域明显有炎症细胞浸润，肺泡结构明显破坏。如图1-1所示。8 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变图1-1：H&E染色2)在Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型中，与对照组（注射PBS组）相比，BLM处理组中肺泡区域Masson染色明显，表明胶原大量分泌。综合本结果和H&E染色结果，可以得出BLM诱导的小鼠肺纤维化模型成功。结果如图1-2。图1-2：Masson染色9 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变1.2.21)在Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化造模后，利用流式分选技术根据肺泡干细胞表面标志物的表达情况分选，肺泡干细胞分选策略为EpCAM+CD24-Sca-1-。结果如图1-3。图1-32）肺泡干细胞培养发现，BLM诱导的肺损伤中肺泡干细胞克隆形成率降低，克隆直径变小，提示肺泡干细胞增殖功能在IPF中下降，与对照组相比具有统计学意义。结果如图1-4、1-5。10 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变图1-4图1-511 天津医科大学硕士学位论文一、BLM诱导的小鼠肺纤维化中肺泡干细胞功能改变1.3讨论博莱霉素可以诱导小鼠肺纤维化，肺纤维化和氧化应激有着紧密联系。应激是指机体在受到刺激作用时出现的一种非特异性的全身反应。适度应激可以使机体更好的适应外界条件的变化。过度的应激却产生很大的不良反应，甚至出现休克、器官衰竭及死亡。氧化应激是由于活性氧相对过多引起。注入博莱霉素后，使小鼠的肺组织受到损伤，影响到肺组织对氧气的扩散功能，即是一种氧化应激，应激后肺组织产生更多胶原纤维，继而导致整体上的肺纤维化。显微镜下肺纤维化小鼠肺组织结构紊乱，胶原纤维过多沉积，可能是因为肺泡干细胞增殖功能降低，使肺部细胞不能及时正确的进行上皮细胞的修复，以至于异常的成纤维细胞代替正常的肺泡上皮细胞，肺结构不能生长为原来的样貌。影响肺的通气功能与换气功能，导致进行性低氧血症。下一步实验，我们将探讨是什么原因导致了IPF肺的病理生理的改变。1.4小结博莱霉素诱导小鼠肺泡损伤，造成肺纤维化，经干细胞功能分析后发现，与注射PBS组相比，肺泡干细胞增殖功能显著降低。12 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能为了研究IPF中肺泡干细胞功能低下的原因，我们测的Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型肺泡灌洗液中H2O2浓度。然后应用流式细胞仪对小鼠AT2细胞进行分析、分选，对小鼠AT2细胞进行体外培养，在细胞培养过程中分别加入PBS、H2O2、H2O2+GSH，利用显微镜观察小鼠AT2细胞的增殖、分化情况，并进行统计分析，利用细胞生物学方法探讨H2O2对2型肺泡上皮增殖、分化的影响。2.1对象和方法2.1.1实验对象（1）C57BL/6小鼠：饲养于SPF级环境，健康小鼠体重18-25g，8-12周龄。实验小鼠由天津市海河医院SPF级动物饲养室〈许可证号：SYXK（津）20160002）2.1.2实验方法主要实验试剂与1.1.2相同主要实验耗材及仪器与1.1.2相同2.1.2.1收集肺泡灌洗液（1）7.5%水合氯醛麻醉上述经博莱霉素诱导的小鼠。并固定于操作板上；（2）70％的酒精喷撒小鼠消毒，依次剪开小鼠皮肤、筋膜和腹肌；（3）剪断肠系膜动脉，使小鼠失血，后用纱布吸尽腹腔血液，充分暴露视野；（4）剪开小鼠横膈膜，使肺放气；（5）分离小鼠主气管周围肌肉和组织，擦拭周围血液，充分暴露气管；（6）施行气管插管，注意不要插管太深，以免插入左右主支气管或肺组织，后丝线打结，固定；（7）剪开左侧胸腔，注意不要碰触肺组织，并剪断左侧锁骨；（8）用5ml灌满1×PBS的注射器心脏灌流三次，肺变白表示成功；（9）用1ml装有EGTA的注射器从气管插管中注入EGTA，并收集肺泡灌洗液；2.1.2.2测肺泡灌洗液中H2O2浓度操作原理：荧光过氧化氢检测试剂盒提供了一种简单且可重复的方法来定量各种样品（如细胞提取物和溶液）中的过氧化氢水平。该试剂盒也可用于检13 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能测活细胞释放的过氧化氢浓度或氧化酶活性产生的过氧化氢浓度。该试剂盒采用过氧化物酶底物，与过氧化氢反应后可产生红色荧光产物（λex=540/λem=590nm），可通过荧光酶标仪进行分析（1）制备过氧化氢标准：将22.7微升3％H2O2溶液加入到977微升缓冲液中以制备20mMH2O2原液。加1μL的20mM储备溶液加入1,999μL的缓冲液中以获得10μM的工作溶液。进一步稀释10μM工作溶液以制备10,3,1,0.3,0.1，0.03,0.01和0μM标准。将50μL制备的标准加入到96孔板的适当孔中。注意：稀释后的溶液不稳定，应该丢弃未使用的部分。（2）制备样品制备：将最多50μL的样品加入孔中。用缓冲液将样品带至最终体积50μL。（3）制备反应混合物：反应混合物如下表格：试剂容积红色过氧化物酶底物50μL20单位/mL过氧化物酶储备200μL缓冲液4.75mL（4）向每个孔（样品，标准品和对照）添加50μLMasterMix。充分混合并在室温下静置板15-30min。在孵化期间保护平板免受光照。（5）测量荧光强度在（λex=540/λem=590nm），使用荧光读板器。（6）计算：测定的背景空白值是0（空白）过氧化氢标准品的值。通过从所有读数中减去空白值来校正背景值。背景值可能很重要，必须从所有读数中减去。样品的过氧化氢浓度可以从标准曲线确定。2.1.2.3肺泡上皮细胞的分离步骤如1.1.2.1中1）干细胞分选2.1.2.4气道上皮干细胞的培养细胞培养：分选得AT2细胞与肺成纤维细胞混合均匀，注入Matrigel胶继续混合均匀后，一起注于24孔板小室（GreinerBio-One）中，后放于37℃恒温培养箱30min，令Matrigel胶凝固。在对照组培养基中加入PBS，在实验组培养基中分别加入H2O2、H2O2+GSH，隔一天换一次培养基，直到培养6天后，在显微镜下观察AT2细胞的生长现象，计算每100个细胞长成球状结构的数量（克隆形成率）。比较对照组与实验组克隆形成率变化，判断过氧化氢对AT2细胞增殖功能的影响。2.1.2.6肺泡上皮干细胞的基因表达14 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能操作原理：把分离的AT2细胞在3D培养条件下生长10天后，培养条件从生培养液换成分化培养液(OMEM/Fl2+10%FBS）继续培养4天，以促进AT2细胞分化。培养结束后，评估SPC(AT2细胞标志物)和Tla(AT1细胞标志物）的表达情况。细胞RNA提取（1）先75%酒精喷洒实验用具，再DEPC无酶水洁净，充分实验前准备；（2）解冻肺组织，放入离心机中，离心，12000转/每分钟，时长10分钟；（3）弃去沉淀，留取上清，并转移至另一个EP管中；（4）于EP管中加入400ul体积氯仿，混合均匀，室温下静置3分钟；（5）对EP管进行配平后，放于离心机中，10000转/每分钟，离心时间为20分钟。（6）离心后EP管中液体分3层，取出上清300-450ul，中层白色为蛋白质，注意不要触及中层；（7）注入与取出上清同样量的异丙醇，混合均匀后静置10分钟；（8）对EP管进行配平后，放入离心机中，12000转/每分钟离心，时长10min；（9）弃上清，EP管倒置，以使EP管沥干；（10）加入1ml75%乙醇于EP管，注意配平，离心速度7000转/每分钟，时长5min；（11）再次弃上清，EP管倒置，以使EP管沥干；（12）再次于EP管中加入75%乙醇300ul，离心速度7000转/每分钟，时长5min；（13）室温下放置15min；（14）加入RNAse-freewater30ul,充分震荡，55℃下，时长10min；（15）测定所得RNA浓度。实时定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）反转录反应（1）分别从样本中取2μlRNA，应用紫外光度计测定其浓度；（2）经计算后，把样本的RNA浓度稀释到40ng/μl，混合均匀，放于离心机离心；（3）置于PCR仪中进行反转录，得到相应的cDNA；（4）根据Realtime-PCR体系，配好各样本的反应体系，混合均匀，离心后置于实时定量PCR仪中；15 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能（5）在PCR仪中：经过预变性、变性、复性、延伸。40次循环。（6）处理实验数据，采用t检验，*代表p<0.05，有统计学差异，**代表p<0.01有显著统计学差异。2.2结果2.2.1在Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型肺泡灌洗液中，与对照组（注射PBS组）相比过氧化氢浓度明显升高，且具有统计学意义。如图2-1所示。图2-12.2.21)加入过氧化氢的AT2细胞克隆形成率及克隆直径降低，且有统计学意义。结果如图2-2、2-3、2-4。图2-216 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能图2-3图2-42.2.22)加入抗氧化剂还原型谷胱甘肽可以部分抵消H2O2对肺泡干细胞功能的抑制作用。如图2-5示。17 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能图2-52.2.3在Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型中，肺泡干细胞分化功能也受18 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能损，表现为AT1细胞标志物表达下降，H2O2抑制了AT2细胞向AT1细胞的分化，加入抗氧化剂GSH可以部分抵消H2O2对AT2分化功能的抑制，与对照组相比且具有统计学意义。如图2-6所示。图2-62.3讨论肺组织的功能和结构复杂，肺泡由有序排列的上皮细胞组成，肺泡上皮细胞的调整满足了肺脏的功能需求，例如分泌肺泡表面活性剂及防御功能[25]在肺肺组织中不同的级别的气管上皮存在着不同的干细胞，以保障不同部位功能的需要。功能性组织再生对于严重损伤后恢复正常器官体内平衡是必需的。关于肺泡上皮干细胞在自我更新以及受损修复中的重要作用的研究越来越多。消化系统等组织更新较快，但肺组织不同，肺上皮干细胞更新周期时间较长、再生能力较有限，同时由于肺泡上皮干细胞缺少特异标记物，所以研究肺泡上皮干19 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能细胞比研究其它组织更为困难[26]。治疗肺纤维化的药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂，但目前效果均不佳，副作用却比较严重。研究表明，糖皮质激素对治疗肺纤维化的效果不佳，原因可能是与糖皮质激素抑制2型肺泡上皮细胞增殖和促进2型肺泡上皮细胞凋亡［27-28］有关。若2型肺泡上皮细胞凋亡，则其会丧失抑制成纤维细胞增殖的［29］功能，导致成纤维细胞过度的增生，引起肺纤维化的发生。因此，对肺纤维化的进一步研究己经越来越迫切。肺纤维化仍然是一种无法有效治疗的肺疾病，目前的研究大多集中在上皮细胞间质转化上，取得的实质进展不大。我们将从AT2作为肺泡干细胞的角度来研究其功能的改变与肺纤维化的关系。考查自噬对肺泡上皮干细胞增殖分化的调控，并利用小鼠纤维化模型研究肺泡干细胞自噬与肺纤维化进程的的关系，为探索通过恢复肺泡上皮细胞正常结构与功能开发治疗肺纤维的新药提供理论依据。之前动物模型已经证明2型肺泡上皮细胞移植能明显减轻博莱霉素诱导的肺损伤，但是并没有完全修复肺泡上皮粘膜[30-31]。这提示，静息态下的2型肺泡上皮细胞经移植后IPF的效果可能并不理想。对2型肺泡上皮细胞进行适当的预处理，使其从静息状态向再生修复状态转变后，移植的疗效应该会更好。细胞自噬在干细胞激活与功能转化中发挥重要作用[32-33]。利用ATG4f/f小鼠模型研究发现，细胞自噬功能缺失加重博莱霉素诱导的肺损伤，提示细胞自噬在AT2干细胞再生功能调控及IPF的发生发展中的可能作用[34]。Rapamycin（mTOR抑制剂，细胞自噬激活剂）预处理小鼠后，博莱霉素诱导的肺损伤程度明显低于对照组[35]。根据这些研究推测，细胞自噬可能促进2型肺泡上皮细胞的再生功能，激活2型肺泡上皮细胞自噬活性可能促进其治疗IPF的作用。目前尚未见相关报道，需要进一步检验。但依据本研究的第二部分结果，我们得出过氧化氢对肺泡上皮干细胞造成损伤，研究的意义在于初步确立了在体外实验中过氧化氢可抑制了肺泡上皮干细胞的增殖、分化过程，为更进一步研究肺泡上皮干细胞提供了令一种理论基础。然而，在体内细胞自噬在什么情况下发挥作用，以及细胞自噬对肺泡上皮干细胞的增殖、分化功能是促进还是抑制？这需要以后更深层次的研究。2.4小结本实验利用FACS术提取出肺泡上皮干细胞，实验结果提示过氧化氢上调导20 天津医科大学硕士学位论文二、过氧化氢调控肺泡干细胞再生功能致肺泡上皮干细胞的增殖分化功能受到抑制，下一步我们将进一步验证过氧化氢是否通过调节细胞自噬以达到对肺泡上皮干细胞增殖和分化功能的抑制作用。21 天津医科大学硕士学位论文结论结论1、Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型中，肺组织炎性浸润，肺泡结构紊乱，胶原大量生成，肺泡干细胞再生功能限制、降低。2、BLM诱导小鼠肺损伤后，肺泡灌洗液中H2O2浓度升高。3、H2O2抑制肺泡干细胞增殖与分化功能，加入抗氧化剂可部分抵消H2O2的抑制作用。肺纤维化病理学和流行病学。氧化应激与IPF的病理学息息相关。近来的研究表明氧化应激可启动细胞自噬。雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR，现在称为雷帕霉素的机制靶标）被认为是细胞生长的主要调节剂。mTOR对细胞生长和细胞大小的调节是复杂的，涉及对合成代谢和分解代谢过程的严格调控。在生长信号输入后，mTOR增强了一系列合成代谢过程，协调大分子的生物合成以建立细胞生物量，同时限制分解代谢过程如细胞自噬，雷帕霉素也是细胞自噬的激活剂。细胞自噬被认为是机体的一种自我保护机制，可以选择性的去除受损、老化的细胞，并利用其中的小分子再次合成新的有正常功能的细胞。肺泡上皮粘膜存在健全的再生与修复机制，以维持正常结构与功能。下一步研究需要澄清IPF中氧化应激对细胞自噬的诱导作用，探索细胞自噬在IPF病生理学中的作用机制。总的来说，有效降低肺组织的氧化应激水平，对于肺泡上皮结构的恢复至关重要。目前干细胞治疗肺部疾病已经取得初步的成果，但是疗效还需要优化。干细胞治疗配合传统治疗方案对IPF的根治将带来变革性的突破。22 天津医科大学硕士学位论文参考文献参考文献[1]Noble,P.W.&Jiang,D.Matrixregulationoflunginjury,inflammation,andrepair:theroleofinnateimmunity.ProceedingsoftheAmericanThoracicSociety3,401-404,(2006).[2]Coultas,D.B.,Zumwalt,R.E.,Black,W.C.&Sobonya,R.E.Theepidemiologyofinterstitiallungdiseases.Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine150,967-972,(1994).[3]Sime,P.J.&0’Reilly,K.M.Fibrosisofthelungandothertissues:newconceptsinpathogenesisandtreatment.Clinicalimmunology99,308-319,(r2001).[4]Barkauskas,C.E.etal.Type2alveolarcellsarestemcellsinadultlung.TheJournalofclinicalinvestigation123,(2013).[5]Guillamat-Prats，R.，Gay-Jordi,G.,Xaubet,A.,Peinado,V.I.&Serrano-Mollar,A.AlveolartypeIIcelltransplantationrestorespulmonarysurfactantproteinlevelsinlungfibrosis.TheJournalofheartandlungtransplantation:theofficialpublicationoftheInternationalSocietyforHeartTransplatation33,758-765,(2014).[6]Alder,J.K.etal.Telomeredysfunctioncausesalveolarstemcellfailure.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica112,5099-5104,(2015).[7]Garcia,O.etal.TargetedType2AlveolarCellDepletionProvidesaDynamicFunctionalModelforLungInjuryRepair.Americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology,(2015).[8]McQualter,J.L.etal.TGF-betasignalinginstromalcellsactsupstreamofFGF-10toregulateepithelialstemcellgrowthintheadultlung.Stemcellresearch11,1222-1233,(2013).[9]Henderson,W.R.,Jr.etal.InhibitionofWnt/beta-catenin/CREBbindingprotein(CBP）signalingreversespulmonaryfibrosis.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica107,14309-14314,(2010).23 天津医科大学硕士学位论文参考文献[10]Tanjore,H.etal.beta-catenininthealveolarepitheliumprotectsfromlungfibrosisafterintratrachealbleomycin.Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine187,630-639,(2013).[11]Konigshoff,M.etal.FunctionalWntsignalingisincreasedinidiopathicpulmonaryfibrosis.PloSone3,e2142,(2008).[12]LiX,YangL,SunX,WuJ,LiY,ZhangQ,ZhangY,LiK,WuQ,ChenH.TheroleofTGFβ‑HGF‑Smad4axisinregulatingtheproliferationofmouseairwayprogenitorcells.MolMedRep.16(6):8155-8163.,(2017).[13]LiK,WuQ,SunX,GengY,LengD,LiH,ZhangS,WangQ,WuJ,XuL,LiX,LiY,ZhangQ,KurkciyanA,LiangJ,JiangD,ChenH.Tsp1promotesalveolarstemcellproliferationanditsdown-regulationrelatestolunginflammationinintralobarpulmonarysequestration.Oncotarget.8(39):64867-64877.(2017).[14]Desai,T.J.,Brownfield,D.G.&Krasnow,M.A.Alveolarprogenitorandstemcellsinlungdevelopment,renewalandcancer.Nature,507,190-194,(2014).[15]Yanagi,S.etal.Ptencontrolslungmorphogenesis,bronchioalveolarstemcells,andonsetoflungadenocarcinomasinmice.TheJournalofclinicalinvestigation117,2929-2940,(2007).[16]LiJ,ZhouQ,YangT,LiY,ZhangY,WangJ,JiaoZ.SGK1inhibitsPM2.5-inducedapoptosisandoxidativestressinhumanlungalveolarepithelialA549 cells.BiochemBiophysResCommun.496(4):1291-1295.(2018).,[17]LaoX,ChenS,DaiY,SongY.Cellularstressresponseandpulmonaryinflammation.MicrobesInfect.16(10):871-6.(2014).[18]GorowiecMR,BorthwickLA,ParkerSM,KirbyJA,SaretzkiGC,FisherAJ.Freeradicalgenerationinducesepithelial-to-mesenchymaltransitioninlungepitheliumviaaTGF-β1-dependentmechanism.FreeRadicBiolMed.52(6):1024-32.(2012).[19]RamachandranA,PrabhuR,ThomasS,ReddyJB,PulimoodA,BalasubramanianKA.Intestinalmucosalalterationsinexperimentalcirrhosisintherat:roleofoxygenfreeradicals.Hepatology.35(3):622-9.(2002).[20]MasseyVL,DolinCE,PooleLG,HudsonSV,SiowDL,BrockGN,Merchant24 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天津医科大学硕士学位论文参考文献Pathol,2000,190(2):221229.[30]Serrano-MollarA,NacherM,Gay-JordiG,ClosaD,XaubetA,BulbenaO.IntratrachealtransplantationofalveolartypeIIcellsreversesbleomycin-inducedlungfibrosis.AmJRespirCritCareMed.176(12):1261-8.2007[31]Guillamat-PratsR,Gay-JordiG,XaubetA,PeinadoVI,Serrano-MollarA.AlveolartypeIIcelltransplantationrestorespulmonarysurfactantproteinlevelsinlungfibrosis.JHeartLungTransplant.33(7):758-65.2014[32]García-PratL,Martínez-VicenteM,PerdigueroE,OrtetL,Rodríguez-UbrevaJ,RebolloE,Ruiz-BonillaV,GutarraS,BallestarE,SerranoAL,SandriM,Muñoz-CánovesP.Autophagymaintainsstemnessbypreventingsenescence.Nature.529(7584):37-42.2016[33]CaiX,GaoL,TengL,GeJ,OoZM,KumarAR,GillilandDG,MasonPJ,TanK,SpeckNA.Runx1DeficiencyDecreasesRibosomeBiogenesisandConfersStressResistancetoHematopoieticStemandProgenitorCells.CellStemCell.17(2):165-77.2015[34]CabreraS,MacielM,HerreraI,NavaT,VergaraF,GaxiolaM,López-OtínC,SelmanM,PardoA.EssentialrolefortheATG4Bproteaseandautophagyinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis.Autophagy.11(4):670-84.2015[35]GuiYS,WangL,TianX,LiX,MaA,ZhouW,ZengN,ZhangJ,CaiB,ZhangH,ChenJY,XuKF.mTOROveractivationandCompromisedAutophagyinthePathogenesisofPulmonaryFibrosis.PLoSOne.10(9):e0138625.201526 天津医科大学硕士学位论文综述综述肺纤维化与干细胞移植肺纤维化是一种增殖性疾病，增殖性疾病是由于结缔组织细胞无控制的不断产生新的纤维组织，导致纤维组织累计过多。在美国约45％的死亡是继发于纤维增生性疾病，高发病率和高死亡与特发性肺纤维化（IPF）和放射性纤维化有一定的关系[1-2]。适当的纤维化细胞增殖可以使伤口愈合，但若纤维化细胞在治病因素去除后仍长时间增殖将会导致疾病的产生。肺是正常气体交换的重要场所，其正常换气功能的实现很大部分取决于菲薄的肺泡壁。当由于某种原因发生结缔组织细胞产生过多纤维组织后，过多的细胞外基质（ECM）在肺泡周围的不断沉积，造成本来菲薄的呼吸膜持续增厚，通透性降低，气体不容易扩散通过，不仅损害气体交换，还影响肺泡表面活性物质，使正常肺泡塌陷并变成下面的实质细胞[3]。肺泡表明活性物质减少，会降低肺部清除病原菌的能力，降低自身免疫力，导致肺泡膨胀不良，引起限制性通气障碍。暴露于各种诱发损伤的内源性和外源性刺激的肺，如果异常的伤口愈合导致过度的成纤维细胞增殖和基质产生，则会导致纤维增殖性疾病。诱发肺内纤维增殖性疾病的病因性机制往往可能是多种多样的，但是这些疾病共同具有不受控制和进行性纤维化的共同发病机制，这会对肺顺应性和气体交换产生负面影响，最终导致呼吸功能受损。呼吸功能受损可导致低氧血症，严重者并发高碳酸血症，引起呼吸衰竭。低氧血症可使红细胞继发性增多，以代偿氧气的不足，红细胞增多后，会引起血流较慢，血流瘀滞，导致深静脉血栓形成，静脉血栓脱落引起肺栓塞等急性猝死情况的发生。研究表明，肺泡上皮粘膜的破损与改变是IPF发生发展的关键因素[4]。目前治疗肺纤维化的药物主要集中在糖皮质激素和免疫抑制剂，但疗效不佳，与之伴随的副作用却比较严重。研究表明，糖皮质激素对治疗肺纤维化的效果不佳，原因可能是与糖皮质激素抑制AT2细胞增殖和促进AT2细胞凋亡有关[5-6]。若AT2细胞凋亡，则其会失去抑制成纤维细胞增殖的能力，造成成纤维细胞过度的增殖，引起肺纤维化的出现[7]。因此，对肺泡上皮粘膜损伤修复机制的深入研究，将加速该疾病新药的开发与治疗新方法的建立。新的治疗方法是迫切需要的。其中干细胞对治疗包括肺部疾病在内的多种27 天津医科大学硕士学位论文综述疾病有很大希望。间充质干细胞（MSC）是中胚层发育的早期细胞，具有干细胞的基本特性，有高度的增殖和自我更新能力，它可分化为具有不同功能的细胞，在个体发育过程中有修复和再生作用，在体外培养和定向的诱导，可使其向定向细胞发展，为相关组织器官损伤的治疗提供了有利条件。目前有正在进行用间充质基质细胞（MSC）治疗肺纤维化人体试验。为了阐明间充质基质细胞（MSC）对人类疾病的潜在作用，通过回顾临床文献，以确定MSCs在博莱霉素诱导肺纤维化动物模型中是否有益。MEDLINE和Embase数据库在肺纤维化动物博莱霉素模型中寻找干细胞疗法的原始研究。选择了17项研究，所有这些研究都在哺乳动物中使用了MSC。在大多数研究中，经MSC治疗后，博莱霉素诱导的动物肺中胶原的沉积和肺纤维化Ashcroft评分改善。几乎在所有研究中，MSC治疗都能改善组织病理学。此外，发现经MSC治疗后，可提高博莱霉素诱导的肺纤维化动物的14天存活率，支气管肺泡灌液总量和中性粒细胞计数以及转化生长因子-β水平也被MSC降低。因此，MSC在博莱霉素诱导的肺纤维化哺乳类动物中是有益的[8].此外，一些数据表明MSC治疗可以降低氧化应激，会降低髓过氧化物酶[9]和氧化型谷胱甘肽水平，尽管超氧化物歧化酶水平没有显着变化，但谷胱甘肽增加[10]。肺脏的功能主要是通气功能与换气功能，通气功能是肺与外界空气的吸入与呼出功能，换气功能主要是在肺组织内部肺泡与血液之间的气体交换。在成人肺中，有超过40种细胞，肺上皮细胞覆盖于呼吸道表面，不同部位的呼吸道有不同类型的上皮细胞。其中AT1细胞和AT2细胞发出于末端细支气管。AT2细胞能够分泌多种肺泡表面活性物质，这些肺泡表面活性物质可以降低肺泡表面张力，增加肺顺应性功能，还具有抗氧化和抗菌作用。在肺组织更新及修复过程中，AT2细胞可以分化为自身的AT2细胞，也可以分化为AT1细胞，被认为是肺泡上皮的干细胞。当机体受到外界剌激，肺泡上皮细胞出现损伤，屏障的完整性遭到破坏，导致肺表面气体交换功能降低，外源物质入侵打乱肺内稳态，引起炎症反应，肺泡结构塌陷等器质性病变。因此，完整的肺泡上皮结构对肺功能的实现非常重要。肺泡上皮是构成肺泡的主要部分，是实现肺表面气体交换的部位。目前临床研究发现，包括特发性肺纤维化、呼吸窘迫综合征、闭塞性细支气管炎在内的多种肺部疾病的发生与肺泡上皮破损紧密相关[11]。特发性肺纤维化是最常见的一种间质性肺疾病，表现为呼吸困难，伴有刺激性干咳，病情呈持续性28 天津医科大学硕士学位论文综述进展，最终导致呼吸衰竭而死亡。发病率约3-5/10万，占所有间质性肺病的65%左右，临床缺乏有效的治疗手段和治疗药物[12]。研究表明肺泡上皮破损是特发性肺纤维化发生发展过程的关键因素[13]。因此，进一步对肺泡上皮损伤修复机制的研究将有助于我们找到针对性的治疗该疾病的方法。2型肺泡上皮细胞增殖分化与肺上皮损伤修复有着密切关系。因此，肺泡干细胞AT2常作为目标细胞来研究肺泡损伤与修复机制[14]。在肺肺组织中不同的级别的气管上皮存在着不同的干细胞，以保障不同部位功能的需要。功能性组织再生对于严重损伤后恢复正常器官体内平衡是必需的。关于肺泡上皮干细胞在自我更新以及受损修复中的重要作用的研究越来越多。消化系统等组织更新较快，但肺组织不同，肺上皮干细胞更新周期时间较长、再生能力较有限，同时由于肺泡上皮干细胞缺少特异标记物，所以研究肺泡上皮干细胞比研究其它组织更为困难[15]。肺部肺泡上皮干细胞在肺部损伤修复过程中发挥着重要的作用，肺泡上皮干细胞通过自我更新以及增殖分化修复受损组织，维持组织稳态。细胞自噬是一种在压力条件下被激活的可降解和循环利用大分子和细胞器的代谢过程，自噬对维持细胞内环境的稳态有重要作用，并与许多疾病尤其是肿瘤的发生发展息息相关，这使得以调控自噬为靶标的新药开发及临床治疗研究越来越受到瞩目。雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR，现在称为雷帕霉素的机制靶标）被认为是细胞生长的主要调节剂。mTOR对细胞生长和细胞大小的调节是复杂的，涉及对合成代谢和分解代谢过程的严格调控。在生长信号输入后，mTOR增强了一系列合成代谢过程，协调大分子的生物合成以建立细胞生物量，同时限制分解代谢过程如细胞自噬，雷帕霉素也是细胞自噬的激活剂。细胞自噬被认为是机体的一种自我保护机制，可以选择性的去除受损、老化的细胞，并利用其中的小分子再次合成新的有正常功能的细胞[16]。2016年，西班牙一研究团队为推动临床IPF干细胞移植治疗，首先对AT2细胞移植方案的临床安全性和移植后的耐受性进行评估。结果发现，募集的16名中度进展性IPF病人进行AT2细胞移植后，没有出现肺功能下降和纤维化恶化症状[17]。随着近年来干细胞移植在造血系统、心脏和胰腺等领域的不断成功，可以预见干细胞移植将在IPF等肺部疾病治疗中掀起一场风暴，成为未来几年甚至几十年的研究和治疗热点。经静脉输入干细胞后，干细胞具有分化为不29 天津医科大学硕士学位论文综述同细胞的属性，在不同部位分化为不同组织，如在肺脏，就分化为肺泡上皮细胞。不同于肝脏、血液等系统，肺组织上皮干细胞增殖自我更细速度慢，引起无法控制的细胞增殖可能性小，因此，肺干细胞移植可能不需要移植后用激素及大剂量免疫抑制剂来控制排异反应。如何提高干细胞治疗效果，使植入的AT2干细胞能够有效再生肺泡上皮粘膜的完整，是目前干细胞治疗的关键问题。虽然动物模型已经证明AT2皮细胞移植能明显减轻博莱霉素诱导的肺损伤，但是并没有完全修复肺泡上皮粘膜[18-19]。这提示，静息态下的AT2细胞经移植后治疗IPF的效果可能并不理想。对AT2细胞进行适当的预处理，使其从静息状态向再生修复状态转变后，移植的疗效应该会更好。细胞自噬在干细胞激活与功能转化中发挥重要作用[20-21]。利用ATG4f/f小鼠模型研究发现，细胞自噬功能缺失加重博莱霉素诱导的肺损伤，提示细胞自噬在AT2干细胞再生功能调控及IPF的发生发展中的可能作用[19]。Rapamycin（mTOR抑制剂，细胞自噬激活剂）预处理小鼠后，博莱霉素诱导的肺损伤程度明显低于对照组[22]。根据这些研究推测，细胞自噬可能促进AT2细胞的再生功能，激活AT2细胞自噬活性可能促进其治疗IPF的作用。目前尚未见相关报道，需要进一步检验。我们利用特定酶分离小鼠肺肺泡上皮细胞，FCM提取2型肺泡上皮细胞；建立BLM诱导的小鼠纤维化模型，测定小鼠肺泡灌洗液中过氧化氢浓度；在体外条件下，培养2型肺泡上皮细胞，对照组只加入基本培养基，实验组分别加入H2O2、H2O2+GSH，在倒置显微镜下进行观察计数克隆直径及数量，并进行统计分析。提取细胞RNA，应用实时定量PCR方法（qRT-PCR）测定基因表达量；我们得到这样的结论：Bleomycin诱导的小鼠肺纤维化模型肺泡灌洗液中H2O2浓度升高，H2O2抑制肺泡上皮细胞的增殖与分化，在过氧化氢基础上再加入抗氧化剂后，肺泡上皮细胞的增殖、分化较单加过氧化氢时增多。这说明氧化应激引起H2O2浓度升高，H2O2损伤肺泡上皮细胞的再生与分泌功能，而加入抗氧化剂后，损伤情况有所缓解。说明抗氧化剂有利于肺泡干细胞的再生，可能为治疗肺纤维化提供一条思路，但一般药物只能减慢肺纤维化的进展，但对于已经受损的肺泡来说，作用不大。因此，肺干细胞移植对于已损伤的上皮干细胞来说更适合。目前对于特发性肺纤维化的药物治疗较少，有效治疗几乎没有。肺纤维化30 天津医科大学硕士学位论文综述为一种发病率较高且不可逆的进行性发展的预后较差的疾病，因此我们希望一种新的治疗方法的出现。干细胞移植已经在血液系统、神经系统、肝脏疾病中开展，并取得了不错的疗效。因此，干细胞移植同样有望解决肺脏肺纤维化等肺部损伤问题。我们需要更进一步的去探索这种解决方法，相信在不久的未来，肺纤维化可以得到有效治疗。31 天津医科大学硕士学位论文综述参考文献综述参考文献[1]Wynn,T.A.FibroticdiseaseandtheT(H)1/T(H)2paradigm.Nat.Rev.Immunol.2004,4,583–594[2]Nanchahal,J.;Hinz,B.Strategiestoovercomethehurdlestotreatfibrosis,amajorunmetclinicalneed.Proc.Natl.Acad.Sci.USA2016,113,7291–7293[3]LAWRENCEJ,NHOR.TheRoleoftheMammalianTargetofRapamycin(mTOR)inPulmonaryFibrosis[J].Internationaljournalofmolecularsciences,2018,19(3):[4]FernandezIE,EickelbergO.Newcellularandmolecularmechanismsoflunginjuryandfibrosisinidiopathicpulmonaryfibrosis.Lancet.380(9842):680-8.2012[5]DorscheidDR,WojcikKR,SunS,etal.Apoptosisofairwayepithelialcellsinducedbycorticosteroids.AmJRespirCritCareMed,2001,16400Pt1):19391947,[6]SalmonM,KotoH,LynchOT,etal.Proliferationofairwayepitheliumafterozoneexposure:effectofapocyninanddexamethasone.AmJRespirCritCareMed,1998,157(3Pt1):970-977.[7]KuwanoK,HagimotoN,TanakaT,etal.Expressionofapoptosisregulatorygenesinepithelialcellsinpulmonaryfibrosisinmice.JPathol,2000,190(2):221229.[8]NadimS,ThébaudB.MesenchymalStromalCellsinAnimalBleomycinPulmonaryFibrosisModels:ASystematicReview.J,STEMCELLSTranslationalMedicine,2015,4(12):1500-1510.[9]GaoF,LiQ,HouLetal.Mesenchymalstemcell-basedangiotensin-convertingenzyme2intreatmentofacutelunginjuryratinducedbybleomycin.ExpLungRes2014;40:392–403.[10]minF,GaoF,LiQetal.Therapeuticeffectofhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsmodifiedbyangiotensin-convertingenzyme2geneonbleomycin-inducedlungfibrosisinjury.MolMedRep2015;11:2387–2396.[11]Noble,P.W.&Jiang,D.Matrixregulationoflunginjury,inflammation,and32 天津医科大学硕士学位论文综述参考文献repair:theroleofinnateimmunity.ProceedingsoftheAmericanThoracicSociety3,401-404,(2006).[12]Coultas,D.B.,Zumwalt,R.E.,Black,W.C.&Sobonya,R.E.Theepidemiologyofinterstitiallungdiseases.Americanjournalofrespiratoryandcriticalcaremedicine150,967-972,(1994).[13]Sime,P.J.&0’Reilly,K.M.Fibrosisofthelungandothertissues:newconceptsinpathogenesisandtreatment.Clinicalimmunology99,308-319,(r2001).[14]Garcia,O.etal.TargetedType2AlveolarCellDepletionProvidesaDynamicFunctionalModelforLungInjuryRepair.Americanjournalofrespiratorycellandmolecularbiology,(2015).[15]尹荟菁,邓炯.肺干细胞和肺癌干细胞的研究进展[J].中国肺癌杂志,2015,18(10):633-639.[16]TEEAR.TheTargetofRapamycinandMechanismsofCellGrowth[J].Internationaljournalofmolecularsciences,2018,19(3):[17]Serrano-MollarA,Gay-JordiG,Guillamat-PratsR,ClosaD,Hernandez-GonzalezF,MarinP,BurgosF,MartorellJ,SánchezM,ArguisP,SoyD,BayasJM,RamirezJ,TetleyTD,MolinsL,delaBellacasaJP,Rodríguez-VillarC,RoviraI,FiblàJJ,XaubetA;PneumocyteStudyGroup.SafetyandTolerabilityofAlveolarTypeIICellTransplantationinIdiopathicPulmonaryFibrosis.Chest.150(3):533-43.2016[18]Serrano-MollarA,NacherM,Gay-JordiG,ClosaD,XaubetA,BulbenaO.IntratrachealtransplantationofalveolartypeIIcellsreversesbleomycin-inducedlungfibrosis.AmJRespirCritCareMed.176(12):1261-8.2007[19]Guillamat-PratsR,Gay-JordiG,XaubetA,PeinadoVI,Serrano-MollarA.AlveolartypeIIcelltransplantationrestorespulmonarysurfactantproteinlevelsinlungfibrosis.JHeartLungTransplant.33(7):758-65.2014[20]García-PratL,Martínez-VicenteM,PerdigueroE,OrtetL,Rodríguez-UbrevaJ,RebolloE,Ruiz-BonillaV,GutarraS,BallestarE,SerranoAL,SandriM,Muñoz-CánovesP.Autophagymaintainsstemnessbypreventingsenescence.Nature.529(7584):37-42.2016[21]CaiX,GaoL,TengL,GeJ,OoZM,KumarAR,GillilandDG,MasonPJ,TanK,33 天津医科大学硕士学位论文综述参考文献SpeckNA.Runx1DeficiencyDecreasesRibosomeBiogenesisandConfersStressResistancetoHematopoieticStemandProgenitorCells.CellStemCell.17(2):165-77.2015[22]CabreraS,MacielM,HerreraI,NavaT,VergaraF,GaxiolaM,López-OtínC,SelmanM,PardoA.EssentialrolefortheATG4Bproteaseandautophagyinbleomycin-inducedpulmonaryfibrosis.Autophagy.11(4):670-84.2015[23]GuiYS,WangL,TianX,LiX,MaA,ZhouW,ZengN,ZhangJ,CaiB,ZhangH,ChenJY,XuKF.mTOROveractivationandCompromisedAutophagyinthePathogenesisofPulmonaryFibrosis.PLoSOne.10(9):e0138625.201534 天津医科大学硕士学位论文致谢致谢2015年来到天津，进入天津医科大学，到现在3年已经过去，研究生即将毕业，面临论文、找工作等一系列问题。老师、家人、朋友给了我很多的关心、指导、与鼓励。首先，感谢导师吴琦教授，吴琦教授是中华医学会结核病学分会副主委，天津市医学会呼吸病学分会主委，天津市海河医院院长。吴老师工作认真负责，每次跟老师出门诊，老师都会很耐心的听患者诉说病情及和病情无关的一些诉说，除了给予专业的治疗，还给予改善生活方式的指导、心理上的宽慰；吴琦老师对患者热心，可以站在患者角度替患者思考，有的患者诉说经济条件困难，如需要开药、检查，老师会让他把专家门诊号退掉，换成最便宜的普通门诊号去取药，做检查。如果考虑他们不需要再开药，就会让患者退掉专家门诊号；吴琦老师对专业问题精益求精的同时还不断追求、扩展新知识，及其他专业的相关知识，还会督促我们去学习、扩充知识；吴琦老师对我们这些学生也关心，每逢农历八月十五的节日，吴老师会给我们这些在外求学的学生送来代表团聚、代表家庭温暖的月饼；当我们遇到困难，迷茫不知所措的时候，吴老师总能给我们分析当下，指明前进的方向。在我们面临毕业写论文时，吴老师会关心我们毕业要求，根据我们是专硕还是学硕，提前给我们安排好去处。面临找工作，吴老师会听取我们的想法，帮我们分析发展形势及对我们的面试提供宝贵的指导意见。感谢吴琦老师！同时，感谢实验室陈怀永教授，陈怀永教授目前主要从事肺干细胞、呼吸道上皮再生与重大肺部疾病的关系研究，受自然科学基金委和天津市科委资助。2004年到2008年在美国杜克大学免疫学系GarnettKelsoe教授实验室进行炎症反应的免疫调控机制研究。陈老师对工作认真负责，一直在科研的浩瀚海洋不断追求前进和创新。陈老师事无巨细，都会手把手教我们，比如我们新手去了，他会从进动物房前穿鞋套、戴口罩、手套、帽子及穿隔离衣等这些看起来平常而基础的细节亲身给我们示范，并指出我们不经意间的错误。陈老师以身作则，和我们这些学生一起动手打扫清洁实验室和动物房；在日常中陈老师比较亲民，遇到有留念意义的事时，还会主动拿出自拍竿，用手机和我们自拍留念；陈老师在学术上对我们要求严格，每周都会组织大家一起讲解最新的文献，让我们自己发现创新点及科研思路。每周开会让我们总结上一周做过哪些东西，并整35 天津医科大学硕士学位论文致谢理成PPT，用幻灯片进行讲解。陈老师每天都会在群里发一句英文名句，鼓励大家努力前行，不要被当下困难击倒。感谢陈老师！感谢李雪师姐。李雪师姐是实验室中我的带教老师，李雪师姐是除了陈怀永老师外，实验室里的第一个实验员，在我的印象中李雪师姐很优秀，低调做人，高调做事。李雪师姐虽然资格比较高，但对我们很亲近，有时感觉她像亲人一样，当我们遇到事时，她会帮我们一起想办法解决。她带我做实验，有时我做不好，甚至给她添了麻烦，也不会对我发脾气，只是细心的再教我一遍。她初来海河实验室时，实验室还没有完全成形，条件简陋，设备不全，那时师姐每天都要挤1个多小时的公交远到她母校的实验室去做实验，然后再回海河实验室。但她依然完成了很多实验，发表了很多优秀的文章，参与了很多课题。现在经过他们的努力付出与苦心经营，海河医院实验室已经设备完善，快速发展。她用她的实际经历教给了我一些道理：万事开头难，路都是一步步走出来的，不要抱怨太多，再艰难也要勇敢去面对。感谢李雪师姐！感谢天津市海河医院呼吸科李莉主任、武俊平副主任、余雯雯科住院。让我有机会跟着她们参加海河医院呼吸科每周二的疑难病例讨论，以及每周四的由呼吸科、结核科、影像科等科室参加的专家会诊，让我知道自己的很多不足，扩展了眼界，以及知道知识总是更新的，不能只局限于课本，需要不断学习。感谢她们让我及时认识了我自己的不足，以及有了前进的驱动力！感谢天津市海河医院实验室的李宽、张秋阳，以及徐龙师兄，宋丽佳师妹，感谢杨立师兄，李凡师姐，张素蓓师姐，还有我的室友，给我了温暖和依靠，让我在生活学习中感到不在那么形影单只，无依无靠。感谢在天津医科大学总医院内科系统轮转时，有缘遇到的各位带组主任，他们教会了我不同科室不同疾病的诊断，鉴别诊断，以及治疗，他们的教诲将会深深影响我的职业生涯。感谢辛辛苦苦将我养大供我上学的父母，是他们的理解支持和不放弃，以及无言的爱，才支撑我读完将近十年的医学专业。最后再次感谢帮助过我的每一个人，我会在工作岗位上踏实努力的工作，不断创新、充实自己，为医疗行业做出些许共贡献，以不负你们对我的帮助和期许！刘会金2018年5月于天津36 天津医科大学硕士学位论文个人简历个人简历姓名：性别：女刘会金出生年月：1991年01月籍贯：河南省濮阳市主要学习和工作经历：（从本科开始）2009年9月-2014年7月河南科技大学临床医学专业，获医学学学士学位2015年9月-2018年6月天津医科大学临床医学内科学专业，获医学硕士学位37