昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探

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分类号：S476.13学校代码：10712UDC：632研究生学号：2015050195密级：公开2018届攻读硕士学位研究生学位（毕业）论文昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探学科专业农业昆虫与害虫防治研究方向昆虫生理与生化研究生李景峰指导教师李朝飞教授完成时间2018年5月中国陕西杨凌 Classificationcode:S476.13Universitycode:10712UDC:632Postgraduatenumber:2015050195Confidentialitylevel:publicThesisforMaster’sDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018ROLESOFINSECTAUTOPHAGYPATHWAYINACMNPVINFECTIONMajor:AgriculturalEntomologyandPestManagementResearchfield:InsectPhysiologyandBiochemistryNameofPostgraduate:JingfengLiAdviser:ZhaofeiLiDateofsubmission:May2018YanglingShaanxiChina 中国陕西杨凌中国陕西杨凌 昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探摘要在真核细胞中，自噬（autophagy）对于维持细胞稳态、胁迫响应和免疫病原物侵染具有重要作用。研究表明，宿主细胞利用自噬途径将入侵病毒运送至溶酶体降解，而病毒则借助该途径促进自身复制。目前，自噬在病毒侵染中的作用受到广泛关注。杆状病毒是昆虫的重要病原物，然而，关于昆虫自噬途径与杆状病毒侵染的关系并不清楚。在本文中，采用比较基因组学方法，我们发现大多数（40多个）自噬相关基因高度保守地存在于酵母、人类和已测序的昆虫基因组中。运用实时荧光定量PCR技术，我们检测了苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染粉纹夜蛾（Trichoplusiani）细胞Tnms42和草地贪夜蛾（Spodopterafrugiperda）细胞Sf9不同时间40个自噬相关基因的转录水平变化，结果显示：，几乎所有自噬相关基因的表达在病毒感染后1~6小时之间都有不同程度的变化，而在病毒感染后12~48小时则持续降低。进一步分析发现，在AcMNPV感染的Tnms42与Sf9细胞中大多数自噬相关基因的转录水平变化趋势相同，其中转录水平显著上调的基因为14~22个，而表达水平明显下调的基因在两种细胞系中分别为13和11个。为了检测AcMNPV感染后Sf9细胞中自噬体的形成，我们构建了GFP标签的ATG8重组表达质粒GFP-SfATG8pBlue。瞬时转染GFP-SfATG8pBlue结合AcMNPV感染的结果表明，在病毒感染后36~48小时GFP-ATG8的荧光斑点数显著增加。Westernblot检测发现，在病毒感染后36和48小时出现明显的ATG8-PE条带，揭示在AcMNPV侵染较晚时期显著诱导宿主细胞发生了自噬。最后，通过RNA干扰下调ATG14与ATG101表达，我们发现抑制这两个宿主细胞自噬相关基因的表达显著升高了AcMNPV极早期基因ie1启动子指导的报告基因LacZ的表达，但并未影响AcMNPV晚期基因p6.9启动子指导的报告基因GUS的表达，暗示ATG14与ATG101与AcMNPV出芽型病毒的入侵有关。关键词：草地贪夜蛾；粉纹夜蛾；自噬；AcMNPV；RNA干扰 ROLESOFINSECTAUTOPHAGYPATHWAYINACMNPVINFECTIONABSTRACTIneukaryoticcells,autophagyplaysimportantrolesincellularhomeostasis,stressresponses,andinfectedpathogensimmunity.Autophagycontributestoinnateantiviralimmunitybydeliveringentriedvirusestolysosomesfordegradationoritcanbehijackedbyvirusesforefficientreplication.Recently,rolesofautophagyinviralinfectionreceivedwidespreadattention.Baculovirusesareimportantinsectpathogens.Presently,however,therelationshipbetweenhostcellularautophagypathwayandbaculovirusesinfectionisnotclear.Inthisstudy,thecomparativegenomeanalysisindicatedthatmorethan40autophagy-relatedgenes(ATG)arehighlyconservedinyeast,human,andsequencedinsectgenomes.Quantitativereal-timePCRanalysisofthetranscriptionlevelofmorethan40autophagy-relatedgenesinAcMNPV-infectedTrichoplusianicellsTnms42andSpodopterafrugiperdacellsSf9showedthattheexpressionlevelofalmostalltheATGgeneswaschanged(down-regulatedorup-regulated)during0~6hourspost-infection,andgraduallydown-regulatedduring12~48hourspost-infection.Furtheranalysisrevealedthattheexpressionlevelof14~22ATGgeneswasup-regulatedintheinfectedcelllines,whereas11~13ofthemwasdown-regulated.ToevaluatetheformationofautophagosomeinAcMNPV-infectedSf9cells,aGFP-taggedATG8transient-expressionplasmidGFP-SfATG8pBluewasconstructed.IntransienttransfectedandtheninfectedSf9cells,thenumberoftheGFP-ATG8punctasignificantlyincreasedat36~48hpost-infection.WesternblotanalysisindicatedthatATG8-PEcanbedetectedat36~48hpostinfection.UsingadsRNA-basedRNAinterference,wefoundthatknockdowntheexpressionofATG14andATG101inSf9cellssignificantlydecreasedtheexpressionofareportergeneLacZ,whichiscontrolledbyAcMNPVimmediatelyearlygeneie1promoter,whereasthetheknockdowndidnotaffecttheexpressionofGUS,whichisdirectedbyAcMNPVp6.9latepromoter.TheseresultssuggestthatATG14andATG101mightbeinvolvedinefficiententryofbuddedvirionsofAcMNPV.KEYWORDS:Trichoplusiani,Spodopterafrugiperd,Autophagy,AcMNPV;RNAinterference 目录第一章文献综述......................................................................................................................11.1细胞自噬.....................................................................................................................11.1.1自噬的生理过程及分类..................................................................................11.1.2自噬相关基因及调控机制..............................................................................51.1.3细胞自噬与病毒感染的关系..........................................................................71.2杆状病毒...................................................................................................................111.2.1杆状病毒的特征及分类................................................................................111.2.2杆状病毒的侵染循环与复制........................................................................131.2.3杆状病毒的应用............................................................................................141.3研究目的与意义.......................................................................................................16第二章材料与方法................................................................................................................172.1实验材料...................................................................................................................172.1.1昆虫细胞系、菌株与质粒............................................................................172.1.2相关试剂........................................................................................................172.1.3试剂配制........................................................................................................172.2实验方法...................................................................................................................182.2.1昆虫自噬相关基因注释................................................................................182.2.2大肠杆菌感受态细胞制备............................................................................192.2.3细胞总RNA提取.........................................................................................192.2.4反转录............................................................................................................192.2.5实时荧光定量PCR标准质粒制备..............................................................202.2.6细胞感染........................................................................................................252.2.7基因转录水平检测........................................................................................252.2.8GFP-SfATG8pBlue质粒构建........................................................................252.2.9细胞转染........................................................................................................262.2.10Westernblot检测..........................................................................................272.2.11RNA干扰......................................................................................................272.2.12AcMNPV基因表达检测..............................................................................28第三章结果与分析................................................................................................................293.1昆虫自噬途径相关基因注释...................................................................................293.2自噬相关基因在AcMNPV感染Tnms42细胞中的转录水平变化......................32 3.3自噬相关基因在AcMNPV感染Sf9细胞过程中的转录水平变化.....................353.4AcMNPV感染诱导Sf9细胞中自噬体形成检测...................................................383.5RNA干扰ATG14与ATG101对AcMNPV感染的影响.......................................40参考文献..................................................................................................................................44致谢..................................................................................................................................55作者简介..................................................................................................................................56 第一章文献综述1第一章文献综述1.1细胞自噬细胞自噬（Autophagy），又称为II型程序性细胞死亡（YaronandHermann2011），最早是由科学家于上世纪50年代用电子显微镜在大鼠的肾脏细胞中观察到的一种“自食”现象，之后由Ashford与Porten（1962）正式确认细胞自噬现象的存在。细胞自噬是细胞在面对细胞内外各种环境的影响下，对细胞内错误折叠的蛋白质、受损伤细胞器和有害病原物进行降解以及循环利用的生理过程，广泛存在于真核生物中且在进化上具有很高的保守性。其主要作用在于维持细胞正常的新陈代谢和胞内稳态，尤其当细胞面对胞内或胞外环境变化与胁迫时。因此，细胞自噬与多种机体病理和生理过程有着极其密切的联系（Rosenfeldtetal.，2013）。自噬还在调节细胞凋亡、结构重建和细胞生长发育中起重要作用（Guidoetal.，2015）。1.1.1自噬的生理过程及分类自噬是一种在进化上十分保守的生理过程，其调控机制和相关基因在真核生物中从较低等的酵母到较高等的哺乳动物之间都十分相似。根据降解底物种类与方式的不同，自噬大致可以划分为以下3种类型：分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy，CMA）、微自噬（microautophagy）、及巨自噬（macroautophagy）（Codognoetal.，2005）。微自噬途径主要通过动物细胞的溶酶体或酵母及植物细胞的液泡表面产生凹陷吞噬特定的待降解底物；分子伴侣介导的自噬途径主要是在某种特定的分子伴侣的帮助下使细胞内待降解底物加工并转运至溶酶体中进行降解，当前的研究表明，分子伴侣介导的自噬途径仅存在于哺乳动物中（Pateletal.，2015）；通常所说的自噬主要指巨自噬，其自噬膜源自高尔基体或内质网（Duraesetal.，2015）。本文所研究的均为巨自噬。巨自噬的主要生理过程为：游离的自噬膜或自噬泡（phagophore，PG，也可称之为自噬前体）包裹胞浆中作为自噬底物的部分细胞器、蛋白质或病原微生物，形成封闭的双层膜自噬体（Autophagosome，AP），之后自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体（Autolysosome，AL），最终将自噬体包裹的自噬底物降解（Danieletal.，2016）（图1-1）。根据自噬发生过程中底物是否具有特异性和选择性，细胞自噬又可以分为非选择性自噬（non-selectiveautophagy）和选择性自噬（selectiveautophagy）（Farréetal.，2016）。在很长一段时间里，细胞自噬被认为是一种非选择性的降解途径，这是因为早期对于自噬的研究主要集中于在细胞生理饥饿状态下进行。不过，近期研究表明，即使在外 2昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探界营养充足的条件下，自噬途径也会对一些特殊的细胞器或蛋白质进行选择性的降解。选择性自噬可以对细胞器或某些蛋白质的完整性和数量进行调节，这对于细胞在不同外界环境和胁迫条件下的稳态维持至关重要。一般情况下，选择性自噬始于待降解细胞器的泛素化，之后自噬的货物结合蛋白识别这些泛素化的细胞器并使其直接或间接地与自噬相关蛋白互作形成自噬体膜。尽管细胞器清除的自噬机制与非选择性自噬的机制大致相同，但参与不同细胞器的选择性自噬的相关分子却有着一定的特异性。目前选择性自噬主要包括线粒体自噬（Mitophagy）、过氧化物酶体自噬（Pexophagy）、溶酶体自噬（Lysophagy）、内质网自噬（Reticulophagy）、细胞核自噬（Nucleophagy）、异体自噬（Xenophagy）、脂类自噬（Lipophagy）和核糖体自噬（Ribophagy）（Andingetal.，2017）。当前研究已经证实选择性自噬与神经退行（Nixon，2013）、衰老（Nordgrenetal.，2013）和肾脏损伤（Maejimaetal.，2013）等多种生理变化有关。图1-1细胞自噬的三种主要类型（Lynch-Dayetal.，2010）Figure1-1Threemaintypesofautophagy 第一章文献综述3选择性自噬：1）线粒体自噬（Mitophagy）：对线粒体进行特异性清除的自噬称之为线粒体自噬（Lemasters,2005）。活性氧（ROS）的产生和细胞代谢受损对线粒体造成的损伤会导致细胞内生理活动的大范围紊乱。因此，及时清除受损线粒体对于维持细胞健康至关重要。多种可能造成线粒体损伤的刺激信号都会启动线粒体自噬，如缺氧状态（Bellotetal.，2009）和ROS累积（Franketal.，2012）等。在某些细胞的发育和分化过程中也会有线粒体自噬的发生，如果蝇的中场上皮细胞（Changetal.，2013）。在酵母中，Atg32作为线粒体自噬的受体（Kankietal.，2009），与接头蛋白Atg11结合后会将线粒体转运至作用类似于动物细胞溶酶体的液泡中进行降解。Atg32还可以利用位于N端的AIM结构域与附着于自噬体内膜的Atg8结合，将线粒体转运至自噬体中进行降解。在哺乳动物中，PINK1/Parkin信号通路是线粒体自噬最主要的信号通路（Matsudaetal.，2010），且目前已发现多个受体参与了线粒体自噬，包括p62/SQSTM1（Geisleretal.，2010）、NIX（Novaketal.，2010）、BNIP3（ZhangandNey，2009）、FUNDC1（Liuetal.，2012）、NDP52（CALCOCO2）、TAX1BP1和视神经蛋白OPTN（Lazarouetal.，2015）。当线粒体膜内外电势被破坏时，PINK1蛋白激酶无法被转运至线粒体内膜并累积在线粒体表面，这些累积的PINK1会将泛素磷酸化（Lazarouetal.，2015），进而招募并活化E3泛素连接酶Parkin（Koyanoetal.，2014）。Parkin使线粒体表面蛋白泛素化，自噬相关的受体蛋白识别这些泛素化蛋白，之后起始自噬体的形成并将泛素化的线粒体降解（Sarrafetal.，2013）。最近的研究还发现，在线粒体自噬发生的过程中，Tank结合激酶1（TBK1）可以磷酸化多种自噬受体，产生信号放大效应（Richteretal.，2016）。2）过氧化物酶体自噬（Pexophagy）：过氧化物酶体是真核细胞内一种主要参与脂肪酸和活性氧类物质分解代谢的小型细胞器（TripathiandWalker，2016）。由于过氧化物酶体在清除有毒性的活性氧类物质中的重要作用，及时清除受损伤的过氧化物酶体和形成新的过氧化物酶体十分重要。而对受损伤的过氧化物酶体的特异性降解的自噬过程称为过氧化物酶体自噬（KatarzynaandSuresh，2016）。在酵母中，Atg30和Atg36是过氧化物酶体自噬的特异性受体蛋白（Farréetal.，2008；Motleyetal.，2012）。Atg30和Atg36都可以与过氧化物酶体上的peroxin蛋白互作，以此附着在过氧化物酶体表面并招募自噬相关蛋白起始对过氧化物酶体的特异性自噬降解过程。Atg30和Atg36也可以被磷酸化，磷酸化后的Atg30和Atg36可以利用自身带有的AIM结构域和Atg11结合位点与Atg11及其他自噬相关蛋白互作起始过氧化物酶体自噬，其中，由Hrr25介导的Atg36磷酸化会促进Atg36与自噬体膜的互作（Farréetal.，2013；Tanakaetal.，2014）。哺乳动物体内没有Atg30和Atg36的同源蛋白，而是利用NBR1和p62作为过氧化物酶体自噬的特异性受体介导相关的自噬途径（KatarzynaandSuresh，2016）。 4昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探3）溶酶体自噬（Lysophagy）：溶酶体是动物细胞内一种包含多种酸性水解酶类的单层膜囊泡状细胞器，主要负责细胞内废物和有害物质的消化作用。溶酶体损伤和其中水解酶类的泄露对细胞是有害的（AitsandJäättelä，2013）。所以，及时清除受损溶酶体，将细胞内溶酶体数量控制在正常范围内对保护细胞和维持细胞稳态是必须的。溶酶体自噬就是指通过自噬途径将受损溶酶体进行特异性降解的过程（Hungetal.，2013；Maejimaetal.，2013）。在生物体内，包括β淀粉样蛋白、脂类、蛋白酶、病毒和细菌毒素等会对溶酶体膜造成损伤的物质都会引发溶酶体自噬。当前对于溶酶体自噬的调控机制的认识还比较有限，但已经明确泛素化和接头蛋白p62参与了溶酶体自噬途径（AitsandJäättelä，2013；Maejimaetal.，2013）。4）内质网自噬（Reticulophagy）：内质网是真核细胞内多种囊状膜系统互相沟通组成的三维网络结构，是细胞内绝大多数蛋白质和脂类合成、修饰与加工的基地，其功能的正常与稳定对于细胞健康具有重要意义。未折叠或错误折叠蛋白在内质网中累积会引起内质网应激反应（ERS）和内质网相关蛋白降解（ERAD）（WangandKaufman，2016）。ERS、营养胁迫和雷帕霉素处理都会引发对内质网的选择性自噬即内质网自噬，以此抑制内质网膨胀并维持细胞稳态（Schucketal.，2014；Mochidaetal.，2015）。此外，在哺乳动物中，肝细胞分裂素TCPOBOP处理肝细胞后也会诱导内质网自噬来降解过量的内质网（Yangetal.，2016）。在酵母中，Atg39和Atg40作为特异性受体通过与内质网和Atg8互作介导内质网自噬（Mochidaetal.，2015）。哺乳动物中的内质网自噬由与Atg40功能类似的FAM134B蛋白介导。FAM134B具有使内质网膜重构和切割内质网的能力，并通过与LC3互作将内质网转运至自噬体进行降解（Khaminetsetal.，2015）。除FAM134B外，还有研究表明Bnip3/Nix和p62也可能参与了内质网自噬调控（Hannaetal.，2012；Yangetal.，2016）。5）细胞核自噬（Nucleophagy）：特异性降解细胞核的选择性自噬称为细胞核自噬（Mochidaetal.，2015）。由于大多数情况下将细胞核全部降解对细胞是有害的，所以细胞核自噬一般只是对于部分细胞核组分的自噬（PMN）。在酵母中，PMN特异性降解部分核被膜和核仁，但不包括染色体DNA、核孔复合物和纺锤极体（Farréetal.，2009）。PMN受两个关键蛋白Vac8p和Nvj1p之间的互作所调控（KvamandGoldfarb，2007）。近期研究确认，Atg39为酵母中细胞核自噬的受体（Mochidaetal.，2015）。哺乳动物中关于细胞核自噬现象的报道较少，也并未找到Atg39的同源蛋白。在一项关于人类角质细胞分化的研究中发现，角质细胞通过细胞核自噬降解细胞核完成角质化。而角化不全性疾病患者的角质细胞中仍然保留有细胞核，并且自噬相关基因LC3、WIPI1和ULK1含量均有显著下降，表明细胞核自噬途径受阻与该类疾病有密切关联（Akinduroetal.，2016）。6）异体自噬（Xenophagy）：细胞对于外源入侵物的一种选择性自噬过程称为异 第一章文献综述5体自噬。当病原微生物侵染宿主细胞时，细胞启动异体自噬识别并降解入侵微生物。P62与Ndp52为异体自噬的特异性受体。在外来的病原微生物入侵宿主细胞后，宿主细胞免疫系统识别并泛素化这些外源物质，P62与Ndp52与泛素和LC3相互作用，引发异体自噬（Verlhacetal.，2015）。1.1.2自噬相关基因及调控机制自噬相关基因（autophagy-relatedgene，ATG）的研究最早始于上世纪90年代。1997年，日本科学家大隅良典（YoshinoriOhsumi）克隆得到第一个酵母自噬相关基因并命名为ATG1。之后，一系列其他自噬相关基因及其在哺乳动物中的同源基因被陆续发现，表明自噬途径是真核细胞中普遍存在且高度保守的一种生理代谢活动。当前已经发现并鉴定了18个核心ATG基因（Yoshinori，2014）。细胞自噬是受自噬相关基因的严格调控的，以哺乳动物为例，主要包括三种蛋白复合物的连续激活。这三种蛋白复合物分别是：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ULK1（ATG1同源蛋白）复合物，包括ULK1、FIP200（FAKfamilykinase-interactingproteinof200kDa，ATG17同源蛋白）、ATG13和ATG101（Haraetal.，2008；Hosokawaetal.，2009；Merceretal.，2009）；Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶（PI3KC3）复合物，包括Beclin1（ATG6同源蛋白）、VPS34、VPS15和ATG14L（Itakuraetal.，2008；Matunagaetal.，2009）；ATG16L复合物，包括ATG16L1、ATG5和ATG12（Fujitaetal.，2008）。在营养充足时，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）通过磷酸化自噬起始因子ULK1和ATG13而抑制其活性。在饥饿营养胁迫或雷帕霉素处理条件下，mTORC1合成受到抑制，ULK1和ATG13去磷酸化形成有活性的ULK1复合物。ULK1复合物磷酸化并激活Beclin1-PI3KC3复合物（Russelletal.，2013；Eganetal.，2015）。自噬体膜来源于多种膜供体，包括内质网、高尔基体、内质网-线粒体连接处、内吞体和质膜，VPS34可在这些膜供体表面催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化形成磷脂酰肌醇-3磷酸（Ptdlns3P）富集区域，这些区域的膜被分离出来形成游离的自噬膜或称自噬前体（pre-autophagosomalstructure，PAS）（Geetal.，2013；Haileyetal.，2010；Hamasakietal.，2013；Hayashi-Nishinoetal.，2009；Ravikumaretal.，2010）。在自噬起始阶段，Ptdlns3P结合因子WIPI1-WIPI4识别并结合自噬膜上富集的Ptdlns3P（Proikas-Cezanneetal.，2015），这一过程对于招募ATG16L复合物至关重要。ATG16L复合物的生成过程类似于泛素连接反应，ATG12被ATG7（类E1激活酶）活化后与ATG10（类E2结合酶）发生催化反应（Ichimuraetal.，2000），ATG12与ATG5共价结合形成ATG12-ATG5二聚体，最后与ATG16非共价结合形成多聚体蛋白复合物（Fujitaetal.，2008）。ATG16L复合物形成后会促进LC3的脂化。哺乳动物中存在7种ATG8的同源蛋白，分别为微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associatedprotein1lightchain3，LC3）类的LC3A、LC3B、LC3C和γ-氨基丁酸受体相关蛋白（γ 6昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探-aminobutyricacidreceptor-associatedprotein，GABARAP）类的GABARAP、GABARAPL1、GABARAPL2、GABARAPL3（Choietal.，2018），这里统称为LC3。LC3也是类泛素分子，其C末端可被蛋白水解酶ATG4切割暴露出甘氨酸残基（Kirisakoetal.，2000），之后与ATG7结合并被转运至ATG3（类E2结合酶）（Tanidaetal.，2004）。最后，ATG16L复合物（类E3连接酶）使LC3与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）共价结合形成LC3-Ⅱ（或ATG8-PE）完成LC3的脂化（Mizushimaetal.，1998）。LC3-Ⅱ锚定于游离的自噬膜并介导这些不同来源的自噬膜互相融合延伸，形成完整的自噬体（Nakatogawaetal.，2007）。在自噬的最后阶段即自噬体成熟阶段，RAB7和可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体（SNARE）蛋白家族的STX17修饰自噬体并介导自噬体与溶酶体的融合，最终完成对自噬底物的降解（Itakuraetal.，2012）。Beclin1-PI3KC3复合物亚基ATG14L直接与STX17结合增加STX17-SNAP29复合物稳定性，之后SNAP29与定位于溶酶体的VAMP8互作促进了溶酶体与自噬体的融合（Diaoetal.，2015）。PLEKHM1作为接头蛋白与LC3、RAB7和STX17结合并招募HOPS复合物使自噬体与溶酶体进一步接触（McEwanetal.，2015）。在这一过程中，Beclin1-PI3KC3复合物中的ATG14L亚基被UVRAG替换（Itakuraetal.，2008）。图1-2哺乳动物细胞自噬调控原理简图（Choietal.，2018）Figure1-2Schematicdiagramsummarizingtheregulationofautophagyinmammaliancells 第一章文献综述71.1.3细胞自噬与病毒感染的关系病毒作为专性细胞内寄生物，其在感染过程中必定会与自噬这一维持细胞自稳态的代谢过程发生相互作用。由于自噬的主要功能是对细胞内某些组分进行清除降解，所以在病毒入侵细胞后，细胞自身免疫系统会主动激活自噬对外来的病毒进行降解（Dereticetal.，2013）。此外，自噬还可以促进抗原加工并引发对入侵病毒相应的免疫反应（Romaoetal.，2013；Paludanetal.，2005）。虽然细胞自噬对病毒入侵似乎是不利的，但有些病毒却可以将自噬体转变为自身复制的场所。自噬体提供了一个由膜包裹的具有保护性质环境供病毒进行复制，而且自噬过程中的相关代谢产物和能量同样可以被病毒利用（Heatonetal.，2011）。总之，当前研究表明很多病毒已经逐步进化出多种抵御或利用细胞自噬的策略来促进自身的复制。1.1.3.1自噬限制病毒复制自噬可以降解病毒组分、病毒颗粒和促进病毒复制的细胞因子，因此自噬是细胞内一类重要的内源抗病毒免疫反应。在辛德毕斯病毒（SINV）感染过程中，Beclin1可以显著抑制SINV引起的脑炎（Liangetal.，1998）。自噬受体p62可以与SINV的衣壳蛋白结合并将病毒衣壳转运至自噬体进行降解，而ATG5的缺失会导致细胞对SINV清除的延迟和p62的大量累积（Orvedahletal.，2010）。最近研究发现，范可尼贫血蛋白FANCC可以通过与SINV衣壳蛋白互作促进自噬对病毒的降解（Sumpteretal.，2016）。包括脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）在内的小RNA病毒（Picornaviruses）在感染过程中可被半乳凝素8（GAL8）识别，GAL8可起动自噬降解病毒的基因组RNA（Staringetal.，2017）。不过，poliovirus可以利用PLA2G16蛋白逃逸这种特异性识别并保证其基因组的正常递送。另一种小RNA病毒柯萨奇病毒B3（CVB3）可以利用自身编码的蛋白酶2A切割p62从而抑制自噬（Shietal.，2013）。丙型肝炎病毒（HCV）的入侵可以引发细胞自噬已经被广泛证实（Ait-Goughoulteetal.，2008）。HCV不仅可以逃避自噬的降解，还可以利用自噬进行复制。然而，近期的一项研究发现一种内质网跨膜蛋白SHISA5可以与HCV的非结构蛋白5A（NS5A）互作，进而引发自噬来抑制病毒的复制（Kimetal.，2016）。人类免疫缺陷病毒1（HIV-1）即艾滋病病毒在感染宿主细胞的过程中会受到自噬的抑制。为了抵抗宿主的内源免疫反应，HIV-1病毒感染因子Vif会促进宿主限制性因子APOBEC3G的降解（Marinetal.，2003）。相对的，细胞内组蛋白脱乙酰酶6（HDAC6）可以与APOBEC3G结合形成蛋白复合物诱导自噬对Vif进行降解，从而抑制HIV-1的复制（Valeraetal.，2015）。此外，CD4+T细胞利用自噬选择性降解HIV-1的转录激活因子Tat抑制病毒复制（Sagnieretal.，2015）。而在胰岛细胞中，限制性 8昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探因子TRIM5α可以介导自噬激活复合物的组装促进自噬对HIV-1的降解（Ribeiroetal.，2016）。自噬还可以在不依赖降解过程的情况下帮助细胞抑制病毒的复制。诺如病毒（NoV）可引起一种人类可传染的非细菌性肠胃炎（Baldridgeetal.，2016）。在鼠类诺如病毒（MNV）感染小鼠的实验中，干扰素IFNγ介导的抗病毒反应需要主要功能为形成自噬体的ATG5-ATG12-ATG16L1蛋白复合物的参与（Hwangetal.，2012）。然而，在该抗病毒反应中并不需要自噬体和溶酶体融合降解病毒，而是利用LC3将IFNγ诱导的GTP酶运送到MNV复制复合物抑制病毒复制（Bieringetal.，2017）。图1-3自噬介导的抗病毒免疫反应（Dongetal.，2013）Figure1-3Autophagy-mediatedantiviralimmuneresponses1.1.3.2病毒抑制细胞自噬单纯疱疹病毒1（HSV-1）编码的神经毒性因子ICP34.5可以与Beclin1发生互作抑制自噬的发生（Talloczyetal.，2002）。最近还发现TBK1是ICP34.5的靶标蛋白（Kanaietal.，2012），TBK1通过使自噬受体蛋白p62磷酸化调节自噬体的成熟过程。因此，利用ICP34.5抑制TBK1的活性是HSV-1抑制并逃逸自噬降解的另一途径。人巨细胞病毒（HCMV）也编码与ICP34.5功能类似的病毒因子TRS1（Chaumorcel 第一章文献综述9etal.，2012）。TRS1的N端含有与Beclin1互作的结构域，TRS1与Beclin1结合后会抑制自噬。最近，另一个HCMV病毒蛋白IRS1被发现也可以通过与Beclin1互作降低细胞自噬水平（Mounaetal.，2016）。为了抵御细胞自噬，包括卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）和鼠类疱疹病毒68（MHV68）在内的γ-疱疹病毒均含有与BCL-2同源的病毒蛋白，分别为ORF16和M11（Cuconatietal.，2002）。这些病毒BCL-2（vBCL-2）可以模仿细胞BCL-2（cBCL-2）与Beclin1互作抑制自噬（Pattingreetal.，2005）。结构和生化分析结果显示，vBCL-2与Beclin1的亲和性显著高于cBCL-2，并且可以更有效地抑制自噬体形成（Kuetal.，2008）。此外，cBCL-2含有可被JNK激酶磷酸化调控的结构域，而vBCL-2却没有这种结构域（Weietal.，2008），所以vBCL-2可以持续与Beclin1互作。KSHV的K7蛋白可以促进Rubicon与Beclin1互作并抑制VPS34的酶活性，以此阻碍自噬体与溶酶体的融合（Liangetal.，2013）。KSHV还编码一种与细胞内FLIP蛋白同源的vFLIP，vFLIP可以在自噬体膜延伸过程中阻止ATG3与LC3结合，进而有效地抑制细胞自噬的发生（Leeetal.，2009）。HIV-1在感染过程中也存在抑制细胞自噬的策略。尽管HIV-1感染细胞会引发自噬体的形成且病毒蛋白Gag与LC3有明显的共定位现象，但病毒蛋白Nef却可以与Beclin1互作阻碍自噬体的成熟（Kyeietal.，2009）。进一步研究表明，Nef与Beclin1互作会阻碍转录因子TFEB向核内的转运，TFEB的核转运受阻会导致溶酶体相关基因无法正常表达，从而抑制自噬体的成熟过程（Campbelletal.，2015）。1.1.3.3病毒利用细胞自噬进行复制许多RNA病毒甚至可以转而利用细胞自噬进行复制。在细胞自噬发生过程中形成的自噬体是一个封闭的双层膜结构，自噬体的这种结构不仅为病毒的复制复合物提供了良好的支撑平台，而且还可以保护病毒的基因组不被细胞内源免疫系统识别和降解。对脊髓灰质炎病毒（Poliovirus）的研究发现，用自噬诱导剂雷帕霉素处理细胞可促进病毒的复制，而沉默自噬的关键基因后病毒的复制受到抑制（Jacksonetal.，2005）。透射电镜结果显示，Poliovirus感染后细胞内会出现类似自噬体的双层膜囊泡（DMV）作为病毒复制的支架，特异性表达病毒蛋白2BC和3A会促进LC3的脂化和DMV的形成。这些结果表明Poliovirus复制与自噬有着密切的联系。其他的小RNA病毒，例如CVB3和口蹄疫病毒（FMDV）也可以利用自噬进行复制（Robinsonetal.，2014；Berrymanetal.，2012）。CVB3感染细胞后，细胞内自噬体数量显著增加但p62蛋白水平却没有明显变化，而抑制自噬体与溶酶体的融合会有效促进病毒复制，这表明CVB3很好地利用了自噬体促进其复制（Wongetal.，2008）。FMDV在感染的极早期就会引发不依赖VPS34激酶活性的细胞自噬，而且经紫外线灭活的病毒的感染仍然会引发自 10昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探噬体的形成（Berrymanetal.，2012）。黄病毒（Flvivirus）对自噬的利用与内质网有着较为密切的联系（Pauletal.，2015）。起初，由黄病毒感染引发的自噬均被认为是内质网未折叠蛋白质应答反应（UPR）的结果，但之后的研究发现登革热病毒（DENV）和西尼罗病毒（WNV）的非结构蛋白可以在不依赖UPR的情况下引发细胞自噬（Milleretal.，2007；Blazquezetal.，2015）。寨卡病毒（ZIKV）感染人神经前体细胞会导致内质网的重新排布并形成大量密集的囊泡供病毒进行基因组复制和病毒粒子组装（Corteseetal.，2017；Offerdahletal.，2017），感染初级成纤维细胞后也会在细胞内诱导形成自噬体促进病毒复制（Hameletal.，2015）。此外，在ZIKV感染后的小鼠胎盘细胞中LC3脂化程度显著升高，而ZIKV感染ATG16缺失型胎鼠后病毒滴度显著降低，这说明细胞自噬在ZIKV感染过程中具有重要的促进作用（Caoetal.，2017）。在人胚胎神经干细胞中共表达ZIKV的非结构蛋白NS4A和NS4B会降低AKT的磷酸化程度，mTOR受到抑制而引发细胞自噬（Liangetal.，2016）。最近有研究发现，黄病毒会利用自身编码的病毒蛋白酶NS3切割定位在内质网的内质网自噬受体FAM134B从而抑制FAM134B介导的内质网自噬（Lennemannetal.，2017；Khaminetsetal.，2015）。HCV感染细胞会引发自噬体的形成但抑制自噬体与溶酶体融合，这有利于病毒基因组的复制与病毒粒子的产生。HCV的非结构蛋白NS4B在感染早期会诱导Rubicon的大量表达，Rubicon可以抑制自噬体与溶酶体融合导致自噬体的累积，这些累积的自噬体可供HCV进行复制（Wangetal.，2015）。在HCV感染细胞过程中，还会利用一种可以调控自噬的干扰素诱导的GTP酶IRGM激活另一种GTP酶ARF1，引发高尔基体碎片化和细胞自噬，以此促进病毒复制（Gregoireetal.，2011；Hansenetal.，2017）。而HCV的感染还会诱发IRGM诱导的ULK1磷酸化（Chauhanetal.，2015）。除了利用自噬进行复制，目前还发现很多病毒可以利用自噬促进新合成病毒粒子的释放和囊膜包被，例如埃博拉病毒（EBV）和水痘带状疱疹病毒（VZV）（Nowagetal.，2014；Buckinghametal.，2016）。 第一章文献综述11图1-4病毒利用自噬进行复制与释放（Choietal.，2018）Figure1-4Virusesmanipulationofautophagyforreplicationandexocytosis1.2杆状病毒杆状病毒（Baculovirus）是一类在自然界中特异性感染昆虫的DNA病毒，其病毒粒子为杆状，并有一层囊膜包被。病毒核衣壳中包含有长度为80-180kbp的环状双链DNA基因组，预测编码89~183种蛋白。杆状病毒的一个显著特征是它具有两种类型的病毒粒子：一类为包涵体来源型病毒粒子（occlusion-derivedvirions，ODV），包埋于被称为包涵体的蛋白质晶体中，负责在昆虫个体之间水平传播；另一类为出芽型病毒粒子（buddedvirions，BV），负责昆虫细胞和组织之间的系统侵染（Rollieetal.，2013）。ODV和BV具有相似的遗传物质，但其囊膜的来源和病毒侵染中的功能存在差异（图1-5）。杆状病毒可作为安全的生物杀虫剂，外源基因表达与展示载体，以及哺乳动物细胞基因转导载体，在农作物害虫控制、疫苗生产、基因治疗等领域具有广阔的应用前景（Haaseetal.，2015；VanOersetal.，2015；Sun，2015）。1.2.1杆状病毒的特征及分类杆状病毒的基因组一般为80~180kbp的环状双链DNA，预测编码89~183种蛋白。基因组包裹于大小为直径40~60nm和长230~385nm的杆状核衣壳（nucleocapsids）中。核衣壳外有一层囊膜（envelope）包被，BV的囊膜中通常只包 12昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探含一个核衣壳，而ODV的囊膜中通常包含多个核衣壳。多个ODV被包裹于由蛋白质组成的包涵体（occlusionbady，OB）中。OB可保护其中的病毒粒子免受外界环境不利因素的影响和破坏。根据OB的结构特点，杆状病毒可分为核型多角体病毒（nucleopolyhedroviruses，NPVs）和颗粒体病毒（granuloviurses，GVs）（Rohrmann，2013）。NPVs的包涵体为多角体状，直径约为0.5~10μm，主要成分为多角体蛋白（polyhedrinprotein），每个包涵体内含有多个ODV。而GVs的包涵体为颗粒状，直径约为0.4μm，主要成分为颗粒体蛋白（granulinprotein），每个包涵体内一般仅含有单个ODV。根据宿主特异性，杆状病毒还可以划分为四个属，分别为：α-杆状病毒属，宿主为鳞翅目昆虫的NPVs；β-杆状病毒属，宿主为鳞翅目昆虫的GVs；γ-杆状病毒属，宿主为膜翅目昆虫的NPVs；δ-杆状病毒属，宿主为双翅目昆虫的NPVs（Jehleetal.，2006）。其中，α-杆状病毒属又可被分为GroupⅠ和GroupⅡ两类。GroupⅠ类杆状病毒介导膜融合的蛋白是GP64，而GroupⅡ类、β-属和δ-属杆状病毒介导膜融合的是F蛋白。γ-属杆状病毒既不含有GP64，也不含有F蛋白。然而，在GroupⅠ类杆状病毒中仍然含有F蛋白的同源蛋白，但并不介导膜融合，其具体功能未知。所以当前研究普遍认为GP64是GroupⅠ类杆状病毒通过某种重组事件获得的在进化水平上较F蛋白更高级的膜融合蛋白，并且代替F蛋白介导病毒的膜融合（Pearsonetal.，2002；Jiangetal.，2009；Wangetal.，2014）。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirus，AcMNPV）于1994年完成全基因组测序（Ayresetal.，1994），这也是第一个完成全基因组测序的杆状病毒。至今为止，完成全基因组测序的杆状病毒共有73种，包括45种α-属、22种β-属、3种γ-属、1种δ-属和2种未分类杆状病毒（https://talk.ictvonline.org/）。AcMNPV是α-属杆状病毒的代表种，也是目前研究最为较为深入的杆状病毒，其基因组大小为133894bp，预测含有154个ORFs。此外，根据生物信息学技术对这些杆状病毒基因组的分析，目前共确定了37个杆状病毒核心基因，即在所有基因组中都存在的基因（Garavagliaetal.，2012）。这些核心基因的功能涉及多种病毒的侵染过程，包括病毒粒子的装配和释放、基因组的复制与转录、以及参与与宿主蛋白互作和口服感染等（Guo,etal.,2017；Mieleetal.，2011；Yue,etal.,2018）。 第一章文献综述13图1-5杆状病毒两种病毒粒子的结构（Blissard，1996）Figure1-5Schematicofthetwotypesofbaculoviursvirions1.2.2杆状病毒的侵染循环与复制杆状病毒的侵染循环始于昆虫取食被OB污染的植物叶片，也称初始感染（primaryinfection）（A）(图1-6A)。当OB进入昆虫体内后，中肠处的碱性环境条件会使OB蛋白特异性降解并释放出OB中包涵的ODV（图1-6B）。ODV穿过中肠围食膜（图1-6C）与中肠上皮细胞的微绒毛融合进入中肠上皮细胞（图1-6D）。核衣壳进入细胞核后解聚并释放病毒基因组DNA，病毒开始复制。病毒的复制与病毒粒子的组装发生在核内称为病毒发生基质（virogenicstroma）的区域（图1-6E）。完成组装的子代核衣壳穿过核膜到达细胞质膜，在特定的质膜区域包裹上含有GP64或F蛋白的囊膜，出芽形成BV（图1-6F）。BV可以沿着昆虫气管系统或血淋巴扩散并感染昆虫的其它组织细胞，也称二次感染（secondaryinfection）。BV通过内吞途径进入细胞并在细胞核中复制（图1-6G）。新组装的核衣壳有的会出芽继续感染周围细胞（图1-6H），而有的会被囊膜包被形成ODV并被包埋到OB中（图1-6I）。在侵染循环末期，昆虫细胞核内累积了大量的OB（图1-6J）。濒死的幼虫虫体会逐渐液化，最终悬挂在植株顶端死亡（图1-6A），之后虫体表皮破裂并释放大量OB，污染周围植物继续侵染与传播（图1-6）（Williamsetal.，2017）。杆状病毒的复制阶段是由多个有序协调的事件构成。复制始于病毒核衣壳在宿主细胞核中解聚释放病毒基因组。在感染后0~6小时，病毒利用宿主的RNA聚合酶Ⅱ 14昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探转录其早期基因，这些早期基因编码的转录因子会促进病毒基因组转录和晚期基因的表达，同时也可以抑制细胞凋亡。病毒的晚期基因在感染后6~12小时表达，晚期基因编码的蛋白包括一种DNA聚合酶、一种RNA聚合酶、结构蛋白、参与病毒基因组复制与转录的晚期表达因子（LEFs）和一些辅助蛋白。形成病毒子代核衣壳的所需蛋白在病毒感染后6~24小时表达，形成ODV和OB的所需蛋白在病毒感染后18~72小时表达，与此同时病毒基因组也在不断复制。这些基因的表达时序是由其各自的启动子控制的。杆状病毒的感染会引起宿主细胞多种生理变化，包括细胞骨架重构、细胞周期受阻、细胞胁迫反应变化和细胞代谢的变化（Rohrmann，2013；Monteriroetal.，2012）。图1-6杆状病毒侵染循环原理简图（Williamsetal.，2017）Figure1-6Schematicrepresentationofabaculovirusinfectioncycle1.2.3杆状病毒的应用1.2.3.1杆状病毒杀虫剂杆状病毒寄主特异性强，通常一种杆状病毒只能感染一种或几种近源昆虫。而且，杆状病毒对环境和包括人在内的哺乳动物是无害的，所以利用杆状病毒作为生物农药对农林害虫进行生物防治具有重要意义。1975年，世界上第一个商品化的棉铃虫病毒杀虫剂正式投入使用，杆状病毒杀虫剂受到了广泛关注（Inceogluetal.，2006）。目前， 第一章文献综述15世界上共有约60多种杆状病毒杀虫剂被用来防治包括鳞翅目、膜翅目和鞘翅目在内的多种农林害虫。中国第一个商业化的杆状病毒杀虫剂是于1993年被农业部授权的防治棉铃虫的HearNPV乳化剂，该杀虫剂也是目前我国产量最高，使用范围最广的杆状病毒杀虫剂。截止2014年，中国农业部共授权了来自11种病毒的57种商业化病毒杀虫剂，总计年产量超过1600吨（Sun，2015）。另一种应用广泛的杆状病毒杀虫剂是甜菜夜蛾核多角体病毒（SeMNPV），可特异性防治重要的农业害虫甜菜夜蛾。该杀虫剂目前已经获得包括泰国、美国和欧洲多个国家的商业化生产许可（Lasaetal.，2007）。不过，杆状病毒杀虫剂也有一定的缺陷，如生产成本高、稳定性差和杀虫速率较低等。所以，很多带有毒素或激素的杆状病毒杀虫剂被成功研发，使杆状病毒杀虫剂的缺陷得到了良好的改善（Beas-Catenaetal.，2014；Kroemeretal.，2015）。此外，近年来有报道关于某些昆虫对杆状病毒杀虫剂产生了一定的抗性，如苹果蠹蛾对苹果蠹蛾颗粒体病毒（CpGV）产生了一定的抗性（Berlingetal.，2009）。1.2.3.2杆状病毒真核表达系统在杆状病毒感染过程的极晚期，病毒P10蛋白基因和多角体蛋白基因是两个超高表达的基因。杆状病毒真核表达系统正是利用这类及晚期基因的启动子构建的。杆状病毒真核表达载体已经在昆虫细胞中完成了多种外源蛋白的表达，而且在生产疫苗和药物研发等方面也有广泛应用，这使得杆状病毒真核表达系统成为目前最好的真核蛋白表达系统之一（Chambersetal.，2018）。虽然杆状病毒仅能特异性地感染节肢动物，α属GroupⅠ类杆状病毒却能够利用GP64进入哺乳动物的细胞中但不会发生复制或整合到细胞的基因组中（Chenetal.，2011），相较于其他种类的病毒载体更加安全。人类β-干扰素是第一个利用杆状病毒表达系统成功获得的外源蛋白（Smithetal.，1983）。此后，杆状病毒真核表达载体的应用越来越广泛，同时也经历了多次改进。1993年建立的“Bacmid”系统极大地推动了杆状病毒表达载体的应用（Luckowetal.，1993）。在该系统中，人们首先构建了一种像普通质粒一样可以在大肠杆菌体内复制的含有整个AcMNPV基因组的载体Bacmid。载体中包含卡那霉素筛选位点和Tn7转座子转座位点attTn7。构建转移载体时，将外源基因置于病毒多角体蛋白基因启动子之后，两端含有Tn7转座子的侧翼特征序列。将转移载体质粒转化进包含Bacmid的大肠杆菌中，在辅助质粒编码的转座酶的帮助下，外源基因被转座到Bacmid所带有的attTn7转座位点中，携带有外源基因的Bacmid构建完成，可用于后续的转染和蛋白表达。该系统使构建重组杆状病毒的过程大大简化，极大地提高了杆状病毒表达系统的效率，扩大了其应用范围。目前，Bacmid系统也是实验室中研究杆状病毒最常用的方法（Onoetal.，2012）。最近，新发展起来的MultiBac系统可以使一个杆状病毒表达载体合成含有多亚基的复合物（Bergeretal.，2013），这无疑会继续推动杆状病毒真核表达载体的应用价值和范围。 16昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探1.3研究目的与意义细胞自噬是真核生物中广泛存在且十分保守的一种生理代谢途径，对于细胞稳态的维持、内源代谢物的清除和外源病原物的免疫具有重要意义。病毒在感染细胞的过程中，与细胞自噬之间存在着复杂的“博弈”关系，这种关系已成为当今病毒学和细胞生物学研究的热点，受到了广泛关注。杆状病毒作为专一性感染昆虫的一类无脊椎动物病毒，在其侵染过程中必然与昆虫自噬途径发生一系列复杂的互作关系。对于昆虫自噬途径与病毒侵染关系的研究，有利于寻找通过自噬控制昆虫病毒传播的潜在靶标，同时也能够为利用昆虫病毒防控害虫提供新的思路。然而，当前对于病毒与细胞自噬之间的关系主要集中在哺乳动物特别是人类当中，对于昆虫自噬的相关系统研究较少。为了揭示昆虫自噬途径与杆状病毒侵染之间的关系，本研究着重以下几个方面内容：1）系统了解自噬相关基因在昆虫基因组中的分布情况并进行注释；2）利用杆状病毒模式种苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV感染其敏感宿主粉纹夜蛾和草地贪夜蛾的细胞系，定量检测病毒感染过程中自噬相关基因转录水平的变化；3）检测AcMNPV感染后诱导细胞自噬的发生情况；4）初步探索RNA干扰自噬相关基因表达对病毒侵染的影响。研究结果对揭示杆状病毒与宿主细胞互作分子机理具有重要的理论意义。 第二章材料与方法17第二章材料与方法2.1实验材料2.1.1昆虫细胞系、菌株与质粒草地贪夜蛾Sf9细胞系购于美国菌种保藏中心（ATCC），由本实验室冻存；粉纹夜蛾Tnms42细胞系由美国康奈尔大学GaryBlissard教授惠赠。两种细胞系均在27℃培养于含有10%FBS（Gibco）的TNM-FH培养基（Sigma）中。DH5α大肠杆菌菌株和pMD18-T载体均购于TaKaRa公司。昆虫细胞瞬时表达质粒GFPpBlue由本实验室构建，该质粒包含杆状病毒AcMNPVie1基因的启动子和目的蛋白N-端融合GFP的多克隆位点。2.1.2相关试剂反转录试剂盒（PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser）、总RNA提取试剂RNAisoplus、250bpDNALadder、SYBR®PremixExTaqII、高保真ExTaqDNA聚合酶及其buffer和dNTP均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒（QIAEXⅡGelExtractionKit）购自QIAGEN公司；中量质粒提取试剂盒（PureLink®HiPurePlasmidMidiprepKit）购自Invitrogen公司；小量质粒提取试剂盒（E.Z.N.ATMPlasmidMini）和DNA凝胶回收试剂盒（E.Z.N.ATMGelExtractionKit）购自OMEGA公司；预染蛋白质marker（PageRulerTMPrestainedProteinLadder）购自ThermoScientific公司；蛋白酶抑制剂（Proteaseinhibitorcocktail）购自Roche公司；氨苄青霉素购自Wolson公司；T4DNA连接酶及其Buffer和限制性内切酶EcoRI、HindIII、XbaI、BamHI购自Promega公司。TEMED、过硫酸铵和30%聚丙烯酰胺购自Amresco公司；2×MasterMix和RNaseFreeWater购自北京康为世纪公司；0.22μmPVDF膜购自Millipore公司；GFP多克隆抗体购自GenScript公司；GP64单克隆抗体AcV5购自SantaCruz公司；β-actin单克隆抗体购自Abbkine公司；氯化钠、无水乙醇、甲醇、丙三醇等常规试剂购自杨凌三立化玻站。2.1.3试剂配制LB培养基：10g氯化钠、10g胰蛋白胨和5g酵母提取物溶于700ml纯水，混匀后定容至1L，分装，固体培养基则再加入1.5%（w/v）琼脂粉，120℃、20min高压蒸汽灭菌，降至室温后4℃保存。SOB培养基：2.5g酵母提取物、10g胰蛋白胨、5ml250mM氯化钾和0.25g氯化钠溶于纯水混匀定容至500ml，分装，120℃、20min高压蒸汽灭菌，降至室温后每100ml中加入500μl2M氯化镁，混匀4℃保存。 18昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探2M氯化镁：19g氯化镁溶于90ml纯水，120℃、20min高压蒸汽灭菌，降至室温后4℃保存。SOC培养基：已灭菌的SOB培养基中加10ml20%葡萄糖，混匀后4℃保存。6×DNA电泳加样缓冲液：0.05%二甲苯青、36%丙三醇和0.05%溴酚蓝混匀，pH调至7.0，室温下保存。2×蛋白质电泳加样缓冲液：20%丙三醇、10%巯基乙醇、4%SDS、0.125MTris-HCl和0.004%溴酚蓝，pH调至6.8。5×蛋白质电泳缓冲液：71.32g甘氨酸、15.14gTris和50ml10%SDS溶于1L纯水中搅拌均匀。转印缓冲液：2.93g甘氨酸、5.82gTris、200ml甲醇和3.75ml10%SDS溶于1L纯水中搅拌均匀。5×TBS：43.83g氯化钠和6.06gTris溶于500ml纯水，搅拌均匀，0.1MHCl将pH调至8.0，定容至1L，室温保存。TBST：在1×TBS中加入终浓度为0.05%（v/v）的Tween20。细胞裂解液：0.1%TritonX-100、0.15M氯化钠、0.05MTris-HCl和蛋白酶抑制剂，pH调至8.0。50×DNA电泳缓冲液（TAE）：242gTris、100ml0.5MEDTA（pH=8.0）和57.1ml冰醋酸加纯水混匀，定容至1L。PBS缓冲液：0.2g氯化钾、0.27g磷酸二氢钾、8.01g氯化钠和3.58g磷酸氢二钠溶于500ml纯水混匀，pH调至7.4，定容至1L。10%过硫酸铵：0.1g过硫酸铵溶于1ml纯水混匀，4℃保存不超过一周。现用现配。1×牛奶封闭缓冲液：1g脱脂奶粉溶于25mlTBST中混匀，现用现配。可根据实际情况扩大体积。氨苄青霉素工作液：5g氨苄青霉素溶于40ml超纯水中混匀，定容至50ml，0.22μm过滤器除菌后分装，-20℃保存。2.2实验方法2.2.1昆虫自噬相关基因注释以人类和酿酒酵母的自噬相关蛋白的氨基酸序列为模板，在不同昆虫基因组数据库中使用BLASTP以及TBLASTN检索昆虫中的同源蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列（E-ealue<10-5）。所检索的基因组数据库来自6个目13种昆虫，包括膜翅目中的意大利蜜蜂（Apismellifera）、印度跳蚁（Harpegnathossaltator）和蝇蛹金小蜂（Nasoniavitripennis）（http://hymenopteragenome.org），鞘翅目的赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）（http://metazoa.ensembl.org/Tribolium_castaneum/Info/Index），虱目的人体虱（Pediculus 第二章材料与方法19humanuscorporis）（http://www.vectorbase.org），鳞翅目的帝王蝶（Danausplexippus）（http://monarchbase.umassmed.edu）、烟草天蛾（Manducasexta）（http://agripestbase/manduca）和家蚕（Bombyxmori）（http://silkworm.genomics.org.cn），半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum）（http://www.aphidbase.com），双翅目的黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）（http://flybase.org）、致倦库蚊（Culexquinquefasciatus）、冈比亚按蚊（Anophelesgambiae）和埃及伊蚊（Aedesaegypti）（http://www.vectorbase.org）。将检索到的自噬相关蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列在NCBI中再次检索，进行人工核对校正。2.2.2大肠杆菌感受态细胞制备将约20μl保存的DH5α甘油菌加入3ml无任何抗生素的LB液体培养基中，置于摇床中37℃，200rpm过夜培养。将培养好的DH5α按1:100的比例加入200ml新的无任何抗生素的LB液体培养基中，置于摇床37℃，200rpm培养约2.5小时至菌液OD600为0.4~0.6。在超净台中将培养完成的菌液分装至4个预冷的50ml离心管（每管加40ml菌液即可），冰浴20分钟。冰浴完成后离心5分钟（4℃，4000rpm），超净台中去上清后每个离心管中加入4ml预冷0.1M氯化镁（初始菌液体积的1/10）。用5000μl移液器缓慢轻柔地将沉淀重悬至完全混匀，将两管菌液合并至一管，冰浴20分钟。冰浴完成后离心5分钟（4℃，4000rpm），超净台中去上清后每个离心管中加入1.6ml预冷0.1M氯化钙（初始菌液体积的1/50）。用5000μl移液器缓慢轻柔地将沉淀重悬至完全混匀，将两管菌液合并至一管，冰浴1小时。在菌液中加入约1.4ml50%甘油，充分缓慢混匀，在0.6ml离心管中每管80μl分装，-80℃保存。2.2.3细胞总RNA提取使用试剂为TaKaRa公司的RNAisopluskit。首先吸净贴壁生长于T25培养瓶中的Tnms42或Sf9细胞的培养基，缓慢加入3mlPBS（pH7.4），静置1分钟。吸出PBS，加入3mlRNAisoplusTrizol，静置1分钟。用电动移液器反复吹打瓶内细胞，直至细胞全部裂解，之后按每管1ml分装至3个1.5ml离心管中，静置2分钟。每个离心管中加200μl氯仿（1/5RNAisoplusTrizol体积），盖紧离心管盖剧烈摇晃2分钟至液体颜色均匀，再静置5分钟。之后离心15分钟（4℃，12000g），液体分层，取上清转移至新1.5ml离心管。在新离心管中加入与上清等体积的异丙醇，盖紧离心管盖剧烈摇晃2分钟，静置10分钟。离心10分钟（4℃，12000g），弃上清，加入用无RNA酶水配制的75%酒精（现用现配）清洗沉淀。离心5分钟（4℃，7500g），吸净酒精后打开离心管盖自然风干5分钟。最后加入40μl无RNA酶水溶解沉淀，测浓度，-80℃保存。2.2.4反转录使用试剂盒为TaKaRa公司的PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser。首先 20昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探去除基因组DNA，反应体系和反应条件如下：5×gDNAEraserBuffer2.0μlgDNAEraser1.0μlTotalRNA800ngRNaseFreedH2O补至10μl总体积10μl反应液42℃静置2分钟，之后置于4℃之后进行反转录反应，反应体系和反应条件如下：上一步反应液10.0μlPrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1.0μlRTPrimerMix4.0μl5×PrimeScriptBuffer24.0μlRNaseFreedH2O1.0μl总体积20μl反应液37℃静置15分钟后再置于85℃5秒，最后4℃保存。整个反应可根据实际用量扩大体系。2.2.5实时荧光定量PCR标准质粒制备本文中所使用的定量方法均为绝对定量，需要构建包含待测基因片段的质粒制作标准曲线。首先，使用普通PCR方法扩增待检测基因片段，PCR反应体系如下：10×ExTaqBuffer5.0μldNTP（10Mm）4.0μl引物1（5μM）4.0μl引物2（5μM）4.0μlcDNA模板5.0μlExTaqDNA聚合酶0.25μlddH2O27.75μl总体积50μl反应程序为：第一步94℃-3分钟，第二步94℃-30秒，第三步55℃-1分钟，第四步72℃-1分钟，第五步72℃-10分钟，第六步4℃持续，其中第二步到第四步进行30个循环。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特异性，若特异性差则重新设计引物，将含有大小正确且特异的目的片段的电泳胶切下，装入已称重1.5ml离心管中。使用QIAEXIIDNA凝胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤为：1）称量每个离心管中凝胶重量，加入3倍凝胶体积的QXI溶液；2）每管中加入5μl摇匀的QXII（SiO2）溶液，混匀管内溶液； 第二章材料与方法213）离心管放入50℃水浴锅40分钟，期间每隔5~10分钟颠倒混匀一次；4）水浴后离心（13000rpm，2分钟），去上清；5）每管中加500μlQXI溶液，重悬沉淀，离心（13000rpm，2分钟），去上清；6）每管中加700μlPEBuffer，重悬沉淀，离心（13000rpm，2分钟），去上清；7）重复步骤6）；8）13000rpm离心2分钟，在不接触沉淀的情况下尽量吸干上清；9）超净台中开盖风干，直至沉淀变为白色；10）每管中加入11μl纯水，与沉淀充分接触混匀，静置15分钟以上，期间每隔3分钟轻轻混匀，离心（13000rpm，2分钟），取上清进行下一步连接反应。将回收的PCR产物连接至pMD18-T载体，使用载体及相关试剂均购自TaKaRa公司，连接反应体系及条件如下：DNA（PCR回收产物）7.0μlpMD18-T载体0.5μlSolutionⅠ7.5μl总体积15μl反应液混匀，封口，12.5℃金属浴过夜连接。次日早上进行转化，具体步骤如下：1）取相应数量的DH5α感受态细胞冰浴30分钟，缓慢融化；2）超净台中每个连接产物加入一管感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟；3）冰浴后，将感受态细胞置于42℃水浴锅中热激90秒，再冰浴3~5分钟；4）超净台中准备相应数量的新的2ml离心管，每管中加入900μlSOC培养基；5）将热激后的感受态细胞在超净台中加入2ml离心管，封口，置于摇床中震荡培养4小时（37℃，190rpm）；6）取100~150μl培养好的菌液，使用灭菌的L型玻璃棒将菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，置于培养箱中37℃过夜培养。待培养平板上长出清晰菌落后，每个基因选4个独立菌落，在新的含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上划线接种，置于培养箱中37℃过夜培养。待培养完成后，对每个单克隆菌进行PCR鉴定，鉴定反应体系及条件如下：2×MasterMix12.5μlM13-472.0μlM13-482.0μlRNaseFreedH2O8.5μl模板（相应菌落）适量总体积25μl反应程序同初始PCR程序。鉴定产物经凝胶电泳验证，标记好鉴定正确的克隆子 22昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探菌落。取适量鉴定真确克隆子菌落接入3~5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于摇床，震荡培养过夜（37℃，200rpm）。之后，进行小量质粒提取，使用试剂盒为E.Z.N.ATMPlasmidMini，具体步骤为：1）将培养好的菌液加入新的1.5ml离心管中离心2分钟（13000rmp），去上清，可重复几次直至全部菌液完成离心；2）每个离心管中加250μlSolutionⅠ，重悬沉淀，混匀；3）每个离心管中加250μlSolutionⅡ，轻柔颠倒混匀5~8次，持续3~5分钟；4）每个离心管中加350μlSolutionⅢ，轻柔颠倒混匀5~8次，常温离心10分钟（15000rpm）；5）取相应数量吸附柱，每管的上清全部加入到一个吸附柱中，离心2分钟（13000rmp），弃废液；6）每个吸附柱中加入500μlHBCBuffer，离心2分钟（13000rmp），弃废液；7）每个吸附柱中加入700μlDNAWashBuffer，离心2分钟（13000rmp），弃废液；8）重复上一步骤；9）不加任何试剂，吸附柱离心2分钟（13000rmp），弃多余废液；10）将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，吸附柱中加入50~60μl60℃纯水洗脱质粒，室温静置2分钟后离心2分钟（13000rmp），-20℃保存质粒。提取的质粒送上海生工生物工程有限公司进行测序验证，测序正确的质粒进行下一步实验。 第二章材料与方法23表2-1粉纹夜蛾qPCR引物Table2-1qPCRprimersofTrichoplusiani*基因名正向引物（5’—3’）反向引物（5’—3’）扩增片段长度（bp）Atg1attgtatggacagcccagcctactcaggtcacgatgaacgattcc180Atg2tcgccgcgctagacatcaccataagcgctcgcaaccccgtc194Atg3gcagagtatgatcaacactgtgaagcagtgatggacaaggtggtctc147Atg4Acgtagcactcgtcagggtcctgtgccacagtgttaggtcca195Atg4Cccatcgaaagctaagccctacggcatgcaaccccagccacagtc211Atg5gctgctgactgtgcactttaccagtcattttgcagtccaagccataac187Atg6tgtacggttctggtggttttcggtagaataggcatgcggaggtgac186Atg7atgcttgctgttgggtgctgggctgctgcctcggctttcttc183LC3gaatcaaaccaaaccaagccctgtaaggaagccgtcttcatctccatag112GABARAPaattgttgagaaagccccgaagggagaccccattgtggcagatgtc188Atg9gaggagcgtttaggtggtggttggcggctacgtccttggtgtg128Atg10gaattcgaccgggtcattgctatctactatgaagtatggccgctggag133Atg12atgggcggtagatgcggagacccatgcttggcttttacagtagtg203Atg13ttcgccgacaaccacccaatacgcagctcgtcgaactccagaac202Atg14ggcaagcactcacagcagcagcagtgtcttcgcctataaactcc191Atg16atcgtaggagcttcgaatgacttcggtcgtggcttcccgtaatg148Atg17cgacgaggaggtccacagaagacgggaggttggcgtcaaatgtagg138WIPI2acgtcactggtggcgggaaggtcgacgaggcaggtctcttg114WIPI3aaggttgttttgcttgcggaacggttactctgttcggtggatacacgg183Atg24gatgtgcaggcacccagtgctgtctcttgccagctttccacc94Atg35ctaatgacgtacccaccacctcggccttctgcgatttgtatgag106Atg37tatccgtagcttgccgaagagtccgtggcctgtttgaagtag87Atg101cgtggagatgctgcaggacaagtgaacaggtagggctggatgt140Aktacatttggcaaagtggtcctgagtgagcacgcggttctcggta130Alfycaagggttagacacaactgaaggtctcatacaggaacttggagcactg191Bnip3tctagagcgtccagcgtcaaggtgctccactcccacacccag142Fundc1gcgaggccaggtaaagaagatgttccgcctaaaccaacagcag199P62gggacctccttgagtcttacctgctgtttcttggagtcgccttgtc170Parkinattgggtccggcatcgatcacacgcctccgtatcgttccagtatttgc93Pex5cgtcgcgtgttcctgatgtcttggacgagaaggcagcatag135Rsp5ggtcgagttcgagtcagaagtccgtagtacgggttgaacatctcc95Trs85ggttgggccggtgctcttaggcagacgccacgaacttgaactc111AMPKAaagtgaagatcggggaacaccacgtctaatcttgccgaccacatc103AMPKBaagaatggcacggaagcgacccggaacagccttagtgtagtatgg174AMPKGgcacaagcaccacacgatacaagtgtccatagcacgagcctcatc140Tsc13gaacctggaattgtggcatctgtcgcatagtgccatgagagaacttgtg106Ubp3catcgagcgtgccaacagtggagatgtaacagcaacacaacagg130Vps34caagaaggcagagcgactacaggcgactattcctttgatggtgac123Ypt1ggaaagtcatgtctgctgctcacgtgcgcccctctgtagtatg191*注：所有qPCR引物均使用引物设计软件PrimerPremier6设计，由Invitrogen公司合成。 24昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探表2-2草地贪夜蛾qPCR引物Table2-2qPCRprimersofSpodopterafrugiperda基因名正向引物（5’—3’）反向引物（5’—3’）扩增片段长度（bp）Atg1acccgcccgtctacatacctaacgacagcagttccgccaacatca109Atg2gaggagacagagacgcacaacttccgctcacttggcacatggacaa160Atg3gatgaagaggacgacgaggatggagcggtgctaggtctgttgatgg100Atg4Acgactggatgccgctactgttgcttgccaccaatcacgccgat127Atg4Ctggctacttggcaggtgctatcattggttggttggctgttgcttca97Atg5cctcaactaccgtggcatctaactgcttctgcattgtggacatgacttgg162Atg6accgttctcctccttgcgtcttccgcatcaaacttcgtgtcccata172Atg7cgctctggctgtagagatcctagtgtggtatgtcttctgtgtcgctgtt101LC3gacaactatggcgacgaagatggatttgcctgtacctcttggttggact112GABARAPggcttggagacctcgacaagaagattgtggctgatgttggaggaatgac153Atg9cacgaactacgagaccgactgaacgtacaccgacaacacaaccaacac150Atg10gcctggaactcttctggtacattgggggtgctcttgttgtgttattacgg110Atg12ggtgacgacaagcaaactgacgatggtttctctgcatcaactgcccat194Atg13atctccaaatacccgacactcctgaaccatttcatcaccatcctccgtttg136Atg14actccgtgtgaaagtgaaccgtaccgtgactgcttggcttctgtc106Atg16tgaacaccaagccctacagatagcatcctccaactctttccgcacctta186Atg17gccaagtctaaggacgaactctcacgcggttgaagcactggaacgata123WIPI2aatatacgccagccgctcaggtcttcactgccagaatggtgttgct172WIPI3gcgaggtgttactgtgcgagatgttccttgctttgatggctctgatgg157WIPI4cgagatgatagaccgcaccaactgtaggtatcgccagcacttgtatcgt194Atg24ggtgaaggctggtgggaaggaactgctggtgctgctttagtctgaa115Atg35ccaccaagaagtaggaacaccacaatagcacacgaccaccagcaca151Atg37cgacacgactccgaggacgaatatgtgtgagttgcgatgtgatttggt149Atg101cgcacagcaagcacgagaatgcgcccgacaggttgtagtttatctt186Aktctggacaaggacggacacatcaagcgcacgccatctcgtacatcac190Alfytcgtcagtagtggcgtcgtcagggaggcgttggttgttcatcttca103Bnip3caatgactgggtttgggagtggaggatggaggaggtggctgatggt115Fundc1gaaagaagatgccgctgaagatgcataacactgcctcccaaaccaactg195P62ccttcttcttcttcttccgcatccaagcaccagccgtgtccatca120Parkinggcttcatacccgtacaccttcatccacctgagtgcgtgacagattacc159Pex5ggtgtagtgttcaatatcagtcaagtggctcctaatctgttc112Rsp5tgcgttcttcatccgtccattctacgaactgctcctcgtccacagaga163Trs85tccagacacctctcatccactaacaccagacctttcccagccacattc122AMPKAgccatcgcctaccatctcatcatagcctctcgctttgtcctgctgtg176AMPKBggaaacgcagggagtaaccaacctgaacgcttcgccttctttgact103AMPKGccaacgagcaccgcaacgaatcgcagcacgaggtacatcaacaa181Tsc13acggtggctacagtggcaactggagcggtgtatagagggtggtt188Ubp3agccgacagaagcgtgatggagtgccttgttgctgacgatgaga190Vps34tgccagatactcagcgacaatcaacttccaccgaccaccatcacctt193Ypt1cgactacaccacagccaaccaatatctccgccgccatcgtcat114 第二章材料与方法252.2.6细胞感染粉纹夜蛾Tnms42细胞系和草地贪夜蛾Sf9细胞系均使用含10%FBS（胎牛血清，Gibco）的TNM-FH细胞培养基（Sigma），27℃培养。感染时，首先将培养瓶中过夜贴壁培养细胞的培养基移除，将3ml含有野生型AcMNPV-LacZ-GUS（MOI=10TCID50）的培养基缓慢加入培养瓶中，此时开始计算感染时间。细胞静置27℃培养1小时后，移除含有病毒的培养基，重新加入新的无病毒的培养基，27℃培养，每组处理设置三个重复。2.2.7基因转录水平检测在病毒感染细胞后1、3、6、12、18、24、36和48小时，分别收集不同感染时间的细胞和未感染的对照组细胞，提取各组细胞总RNA并反转录为cDNA（具体方法见2.2.3与2.2.4），使用绝对实时荧光定量PCR方法检测各基因转录水平。定量PCR仪为Bio-Red公司的IQ®5MulticolorReal-TimePCRDetectionSystem。反应体系为：2×SYBRPremixExTaqII10.0μl正向引物2.0μl反向引物2.0μlcDNA1.0μlddH2O5.0μl总体积20μl反应条件为95℃-3分钟，95℃-10秒，60℃-30秒，共进行40个循环。制作标准曲线的反应中以相应基因的质粒为模板，反应体系和反应条件不变。结果以单个细胞中该基因的拷贝数表示。2.2.8GFP-SfATG8pBlue质粒构建首先，根据草地贪夜蛾转录组数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/GESP00000000.1）中的ATG8序列设计该基因的特异性引物：正向引物为SfATG8BF：5’-attggatccatgaaattccaatataaagaag-3’，反向引物为SfATG8ER：5’-attgaattcttaataatatccataaacat-3’（下划线标示为BamHI和EcoRI酶切位点）。随后，PCR扩增草地贪夜蛾SfATG8进行扩增（具体方法见2.2.5），使用PCR产物经DNA凝胶电泳验证后使用E.Z.N.ATMGelExtractionKit试剂盒进行胶回收，具体步骤为：1）将含有目的片段的凝胶切下，装入实现称重的1.5ml离心管；2）称量凝胶重量，加入等体积的BindingBuffer，60℃水浴至凝胶完全溶化，混匀；3）准备吸附柱，离心管中液体全部加入吸附柱中离心2分钟（13000rpm），弃废液；4）吸附柱中加入300μlBindingBuffer，离心2分钟（13000rpm），弃废液； 26昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探5）吸附柱中加入700μlSPWWashBuffer，离心2分钟（13000rpm），弃废液；6）重复步骤5）；7）吸附柱中不加任何试剂离心2分钟（13000rpm），弃多余废液；8）将吸附柱转移至新的1.5ml离心管中，吸附柱中加入60μl60℃纯水洗脱DNA，室温静置2分钟后离心2分钟（13000rmp）。回收好的PCR产物直接用限制性内切酶进行双酶切反应，反应体系为：DNA（PCR产物）60.0μlBamHI1.0μlEcoRI1.0μl10×BufferE7.0μlddH2O1.0μl总体积70μl反应液轻柔混匀后37℃静置孵育3小时。酶切产物直接使用QIAEXIIDNA凝胶回收试剂盒进行浓缩，具体步骤大致与2.2.5中胶回收步骤相同，最后沉淀风干后加16μlddH2O溶解DNA，取13μl浓缩产物进行连接反应。对不包含任何目的片段的GFPpBlue载体进行双酶切反应，反应体系为：GFPpBlue16.0μlBamHI1.0μlEcoRI1.0μl10×BufferE2.0μl总体积20μl反应液轻柔混匀后37℃静置孵育3小时。酶切产物直接进行DNA凝胶电泳纯化，之后使用E.Z.N.ATMGelExtractionKit试剂盒进行胶回收，具体步骤同上。将浓缩好的目的片段连入回收的空载体中，连接反应体系为：GFPpBlue（BamHI/EcoRI）4.0μlSfATG8（BamHI/EcoRI）13.0μlT4DNALigase1.0μl10×T4LigaseBuffer2.0μl总体积20μl反应液轻柔混匀，封口，12.5℃金属浴过夜连接。之后，进行转化、划线、PCR鉴定、质粒提取和测序验证（具体方法见2.2.5）。2.2.9细胞转染采用磷酸钙沉淀法（LiandBlissard,2008）进行转染。Sf9细胞在12孔板中过夜贴壁培养。在超净台中准备相应数量的2ml离心管（1管/孔），每个离心管中将2μg 第二章材料与方法27,质粒与600μl转染缓冲液充分混匀，静置3-5分钟，之后加入600μlGraces培养基（Gibco，含10%FBS），充分混匀后静置3~5分钟。缓慢移除细胞孔中的培养基，逐滴缓慢加入离心管中全部转染液，完成一个孔的转染之后再进行下一个孔的操作。转染全部完成后27℃培养4小时，之后将各孔中转染液移除并加入1ml新的TNM-FH培养基，开始计算转染时间。转染12小时后进行病毒感染实验（具体方法见2.2.6），并在感染后不同时间用倒置荧光显微镜观察拍照，之后立即收集细胞进行Westernblot检测。2.2.10Westernblot检测每个样品收集于1个1.5ml离心管中，加入100μl细胞裂解液（0.1%TritonX-100）轻轻悬浮细胞后冰浴30分钟，期间每隔10分钟混匀一次。细胞裂解后各取适量裂解产物进行制样。将裂解产物加入等体积2×蛋白质电泳加样缓冲液，剧烈涡旋震荡混匀后在95℃开水中煮5分钟，之后将样品置于冰上备用。参考《分子克隆实验指南》第三版中10%SDS-PAGE的配方和配制方法配制凝胶，电泳分离蛋白样品。完成电泳后使用半干转印法将凝胶中蛋白样品转至PVDF膜。用相应抗体和辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗检测。2.2.11RNA干扰首先，构建合成dsRNA所需的DNA模板质粒。使用SnapDragon在线引物设计网站（http://www.flyrnai.org/cgi-bin/RNAi_find_primers.pl）设计相应基因的引物，用于合成目的基因中一段300~600bp的片段。同时再额外设计一对在5’端含有T7RNA聚合酶启动子序列（5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’）的引物（表2-3）。使用不含T7启动子序列的引物进行PCR反应扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳验证特异性并回收纯化，连入pMD18-T载体，测序验证（方法同2.2.5）。使用Promega公司的T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem试剂盒体外合成dsRNA。参考该试剂盒说明书，以构建好的含有目的片段的质粒为模板，搭配相应引物进行PCR反应，分别扩增出在PCR产物5’端或3’端含有T7启动子序列的DNA片段，两种PCR产物经凝胶电泳纯化后回收，测定回收产物浓度，各取1μg混合后作为合成dsRNA的模板。dsRNA合成反应体系为：RiboMAX™ExpressT72XBuffer10.0μlDNA模板1-8μlNuclease-FreeWater0-7μlEnzymeMix,T7Express2.0μl总体积20μl反应液37°C静置孵育30分钟。反应完成后，向20μl反应液中分别加入1μl稀释后（1:200）的RNaseA和1ulRQ1RNase-FreeDNase，37°C静置孵育30分钟，以去 28昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探除DNA模板和ssRNA。之后，使用QIAGEN公司的RNeasyMiniKit试剂盒，按照说明书，对合成的dsRNA进行纯化。将纯化后的dsRNA转染Sf9细胞（同2.2.9），每孔转染7.5μgdsRNA。48小时后，定量检测干扰效率，并进行相关病毒感染实验。表2-3合成dsRNA引物Table2-3PrimersforsynthetizedsRNA引物名称序列（5’—3’）GFPiFacgtaaacggccacaagttcGFPiRtgttctgctggtagtggtcgGFPT7iFggatcctaatacgactcactatagggacgtaaacggccacaagttcGFPT7iRggatcctaatacgactcactatagggtgttctgctggtagtggtcgATG14iFctgctgagactggccatacaATG14iRctcctccgtgtcctcacctaATG14T7iFggatcctaatacgactcactatagggctgctgagactggccatacaATG14T7iRggatcctaatacgactcactatagggctcctccgtgtcctcacctaATG101iFgagagctactccatccgcacATG101iRtacgacattctcgtgcttgcATG101T7iFggatcctaatacgactcactataggggagagctactccatccgcacATG101T7iRggatcctaatacgactcactatagggtacgacattctcgtgcttgc2.2.12AcMNPV基因表达检测病毒感染后6小时与24小时，分别收集细胞，并用1%TritonX-100PBS（pH:7.4）裂解细胞。其中，向裂解液中分别加入2mg/ml的CPRG（Chlorophenolred-β-D-galactopyranoside）或PNPG（4-Nitrophenyl-β-D-glucuronide）检测细胞内β-半乳糖苷酶（β-Gal）活性或β-葡萄糖苷酶（GUS）活性。CPRG与PNPG的检测光波长分别为570nm和405nm。 第三章结果与分析29第三章结果与分析3.1昆虫自噬途径相关基因注释目前，在真核生物细胞中共鉴定了约50多个自噬相关基因。根据选择性自噬和非选择性自噬途径的不同，这些自噬相关基因被划分为选择性自噬基因和非选择性自噬基因（Farréetal.，2016）。其中，非选择性自噬基因包括核心ATG和一些其它相关基因，其中ATG蛋白参与所有自噬途径，是自噬体形成所必需的，而其它相关基因所编码的蛋白则可参与非选择性自噬和多种选择性自噬途径。选择性自噬基因所编码的蛋白具有特异性，一般仅参与某一种选择性自噬途径。为了系统解析自噬相关基因在昆虫基因组中的分布情况，我们首先在酵母和人类的基因组中找到这些自噬相关基因或其同源基因的序列。随后，以酵母和人类自噬基因序列作为模板在已完成基因组测序的6个目13种昆虫的基因组数据库中搜索比对同源基因，具体结果如表3-1和表3-2所示。序列分析表明，自噬相关基因在酵母、人类和昆虫中保守程度很高，绝大多数自噬相关基因均可在昆虫基因组中找到其同源序列。然而，有些自噬相关基因在部分昆虫基因组中存在缺失现象，包括Atg4C在豌豆蚜（A.pisum）（半翅目）、蝇蛹金小蜂（N.mitripennis）（膜翅目）和人体虱（P.corporis）（虱目）基因组中缺失；Atg7在致倦库蚊（C.quinquefasciatus）（双翅目）基因组中缺失；LC3在黑腹果蝇（D.melanogaster）、冈比亚按蚊（A.gambiae）、埃及伊蚊（A.aegypti）与致倦库蚊（C.quinquefasciatus）（双翅目）、豌豆蚜（A.pisum）（半翅目）和蝇蛹金小蜂（N.mitripennis）（膜翅目）基因组中缺失；Atg10在人体虱（P.corporis）（虱目）基因组中缺失；Atg12在意大利蜜蜂（A.mellifera）（膜翅目）基因组中缺失；P62在豌豆蚜（A.pisum）（半翅目）和赤拟谷盗（T.castaneum）（鞘翅目）基因组中缺失；Bre5在家蚕（B.mori）（鳞翅目）基因组中缺失。在人类基因组中，多个自噬相关基因存在扩增现象，而昆虫基因组中自噬相关基因的扩增程度较低，只有少数几个基因存在2个或2个以上的同源基因，包括Atg4、Atg8、Atg18和AMPK。此外，少数几个存在于酵母或人类基因组中的自噬相关基因在所分析的13种昆虫基因组中并未发现同源序列，这些基因包括Nbr1、Optn、Ndp52、Atg32和Atg40。还有一部分自噬相关基因仅存在于酵母基因组中，而在人类和昆虫的基因组中均不存在（表3-1，3-2）。 30昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探表3-1酵母，人类与昆虫中的非选择性自噬相关蛋白Table3-1Proteinsrequiredfornon-selectiveautophagyinyeast,human,insects物种分类备注酵母人类昆虫$核心AtgAtg1Ulk1Atg1Ulk2Atg2Atg2AAtg2Atg2BAtg3Atg3+Atg4Atg4AAtg4AAtg4BAtg4CAtg4C豌豆蚜、蝇蛹金小蜂和人体Atg4D虱缺失Atg5Atg5+Atg6Beclin1+Atg7Atg7+致倦库蚊缺失Atg8LC3ALC3果蝇、蝇蛹金小蜂、豌豆蚜、LC3B冈比亚按蚊、埃及伊蚊和致LC3C倦库蚊缺失GABARAPGABARAPGABARAPL1GABARAPL2GABARAPL3Atg9Atg9L1Atg9Atg9L2Atg10Atg10+人体虱缺失Atg12Atg12+意大利蜜蜂缺失Atg13Atg13+Atg14Barkor+Atg16Atg16L1Atg16Atg16L2Atg17FIP200+Atg18WIPI1WIPI2WIPI2WIPI3WIPI3WIPI4WIPI4-Atg101+其他相关蛋白Atg24SNX4+Trs85Trappc8Trs85Vps34Vps34+Sch9pAkt1AktAkt2Akt3-P62+赤拟谷盗和豌豆蚜缺失 第三章结果与分析31续表3-1ContinuedTable3-1物种分类备注酵母人类昆虫$其他相关基因-Nbr1--Optn--Ndp52--Bnip3+-Parkin+表3-2酵母，人类与昆虫中的选择性自噬所需特异蛋白Table3-2Proteinsrequiredspecificallyforselectiveautophagyinyeast,human,insects物种自噬途径备注酵母人类昆虫$糖原自噬Snf1pAMPKA1AMPKAAMPKA2AMPKB1AMPKBAMPKB2AMPKG1AMPKGAMPKG2AMPKG3Bph1pAlfy+聚集体自噬+过氧化物酶体自噬Atg35Atg35Atg37ACBD5+Pex5Pex5+Atg32Bcl2-L-13-线粒体自噬-NIX-Fun14pFundc1+-Pink1-Tsc13Sc2+核自噬Atg40FAM134B-内质网自噬Ypt1Rab1+Bre5G3bp+核糖体自噬家蚕和烟草天蛾缺失Ubp3Usp10+Rsp5NEDD4+注：$代表已完成基因组测序的昆虫，包括豌豆蚜（Acyrthosiphonpisum），埃及伊蚊（Aedesaegypti），冈比亚按蚊（Anophelesgambiae），意大利蜜蜂（Apismellifera），家蚕（Bombyxmori），致倦库蚊（Culexquinquefasciatus），帝王蝶（Danausplexippus），黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster），印度跳蚁（Harpegnathossaltator），烟草天蛾（Manducasexta），蝇蛹金小蜂（Nasoniavitripennis），人体虱（Pediculushumanscorporis），和赤拟谷盗（Triboliumcastaneum）。 32昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探3.2自噬相关基因在AcMNPV感染Tnms42细胞中的转录水平变化2014年，本实验室参与完成了粉纹夜蛾（Trichoplusiani）Tnms42细胞在AcMNPV感染后0~48小时的转录组数据分析（Chenetal.，2014）。随后对转录组数据的进一步分析表明，在AcMNPV感染的Tnms42细胞中，39个自噬相关基因的表达均发生了显著变化（上调或下降）。为了验证转录组数据的准确性，我们首先从粉纹夜蛾的转录组数据库中搜索到39个自噬相关基因的全部或部分mRNA序列并设计相应的定量PCR引物。随后，采用绝对定量PCR技术检测AcMNPV感染Tnms42细胞后0~48小时每一个自噬相关基因的转录水平变化。值得一提的是，在之前的转录组数据中所检测的时间点为病毒感染后1、6、12、18、24、36和48小时。为了更好地了解在病毒感染早期自噬相关基因的转录水平，我们在检测时增加了病毒感染后3小时的时间点。定量PCR结果表明，大多数自噬相关基因的转录水平在病毒感染后0~6小时之间均有不同程度的变化，而在病毒感染后6~48小时则持续降低。其中，在病毒感染后0~6小时之间转录水平明显上调的基因有14个，明显下调的基因有13个，基本保持稳定转录水平的自噬基因有12个。比较有趣的是，5个自噬基因（包括GABARAP、Atg10、Atg12、Fundc1和AMPKA）的转录水平在病毒感染后1小时显著下降，之后随着感染时间的延长又逐渐上升。相比较转录组数据，两种检测方法中绝大多数自噬相关基因的转录水平在病毒感染后的变化趋势基本相同，只是在变化程度上略有差异。值得一提的是，3个自噬基因的定量PCR结果与转录组数据有较为明显的差异，包括：1）P62的转录水平在转录组数据中表现为病毒感染后1小时较未感染细胞略有升高，之后持续下降，而定量PCR结果则表明该基因的转录水平在病毒感染后持续下降；2）Vps34的转录水平在转录组数据中表现为病毒感染后1小时显著升高，之后持续下降，而定量PCR结果显示其转录水平在病毒感染后1~3小时与对照相比较没有显著变化，但在感染后6小时大幅度升高，随着感染时间的延长逐渐下降；3）Ypt1的转录水平在转录组数据中表现为在病毒感染后1~6小时较未感染细胞略有升高，而定量PCR结果则显示该基因的表达在病毒感染后1小时显著升高，之后持续下降。我们推测少数自噬基因的表达差异可能由于实验条件、细胞生长状态以及人为操作的差异所造成。总之，定量PCR结果进一步揭示细胞自噬途径可能在AcMNPV侵染粉纹夜蛾细胞的过程中具有重要作用。 第三章结果与分析33A.CoreAtga.b.c.d.B.Othergenesa.b.c.图3-1AcMNPV侵染过程中Tnms42细胞中非选择性自噬基因的转录水平Figure3-1Transcriptlevelsofnon-selectiveautophagy-relatedgenesinAcMNPV-infectedTnms42cells 34昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探A.Glycophagya.b.B.AggrephagyC.PexophagyD.MitophagyE.NuclophagyF.Ribophagya.b. 第三章结果与分析35G.Reticulophagy图3-2AcMNPV侵染过程中Tnms42细胞中选择性自噬基因的转录水平Figure3-2Transcriptlevelsofselectiveautophagy-relatedgenesinAcMNPV-infectedTnms42cells3.3自噬相关基因在AcMNPV感染Sf9细胞过程中的转录水平变化为了进一步分析AcMNPV感染后昆虫自噬途径基因的表达变化是否与不同宿主细胞的特异性有关，我们检测了AcMNPV感染后不同时间草地贪夜蛾细胞Sf9中各自噬基因的转录水平。首先，我们以昆虫自噬相关基因（表3-1，3-2）序列为模板，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中搜索草地贪夜蛾转录组数据（TSA:Spodopterafrugiperda,transcriptomeshotgunassembly）获得了40个自噬相关基因的全部或部分mRNA序列。随后，根据获得的mRNA序列设计定量PCR引物，采用绝对定量PCR技术检测AcMNPV感染Sf9细胞后0~48小时各自噬相关基因的转录水平。定量PCR结果分析表明，大多数自噬相关基因的转录水平在病毒感染后1~6小时之间都有不同程度的变化，而在病毒感染后6~48小时持续降低。其中，在病毒感染后1~6小时之间转录水平明显上调的自噬相关基因有22个，而表达量明显下调的自噬基因有11个，转录水平维持稳定状态的自噬基因有7个（图3-3，3-4）。相比较病毒感染后Tnms42细胞中自噬相关基因的表达变化，我们发现绝大多数自噬基因的转录水平在病毒感染的两种细胞系中的变化趋势类似，但不同基因的变化程度存在一定的拷贝数差异。其中，Atg3、Atg6、Atg7、Atg37和Akt在Sf9细胞中转录水平变化较大（0.5倍以上），而在Tnms42中的变化较小（0.2倍以下），而AMPKB与Tsc13的转录水平变化程度在两种细胞系中则恰好相反。此外，AMPKG的转录水平在病毒感染Sf9细胞后3小时显著升高，而在Tnms42细胞中则呈持续下降趋势，揭示个别自噬基因的表达可能与细胞系的特异性有关。综合考虑，在AcMNPV感染后不同时间，宿主自噬基因的转录水平变化基本与宿主细胞的特异性无关。 36昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探A.CoreAtga.b.c.d.B.Othergenesa.b.c.d.图3-3AcMNPV侵染过程中Sf9细胞中非选择性自噬基因的转录水平Figure3-3Transcriptlevelsofnon-selectiveautophagy-relatedgenesinAcMNPV-infectedSf9cells 第三章结果与分析37A.Glycophagya.b.B.AggrephagyC.MitophagyD.Pexophagya.b.E.NuclophagyF.Ribophagy 38昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探G.Reticulophagy图3-4AcMNPV侵染过程中Sf9细胞中选择性自噬基因的转录水平Figure3-4Transcriptlevelsofselectiveautophagy-relatedgenesinAcMNPV-infectedSf9cells3.4AcMNPV感染诱导Sf9细胞中自噬体形成检测在自噬体形成过程中，分散于细胞质中的ATG8与PE结合，脂化形成ATG8-PE聚集定位于自噬体双层膜上，这是自噬体形成的标志性现象。因此，利用Westernblot和荧光显微镜检测和观察荧光蛋白标记的ATG8即可实现对宿主细胞中自噬形成（或自噬发生状况）进行检测（Klionskyetal.，2016）。上述序列分析表明（表3-1），在昆虫基因组中存在两个ATG8编码序列，分别与人类LC3和GABARAP同源。其中，昆虫GABARAP与人类的同源蛋白的氨基酸序列一致性高达85%，而昆虫LC3与人类的同源蛋白的氨基酸一致性较低，约为50%。首先，我们克隆了草地贪夜蛾的ATG8（这里ATG8特指GABARAP），PCR产物双酶切后连入预先双酶切并纯化的GFPpBlue载体中，获得在SfATG8的N-端融合GFP的重组表达质粒GFP-SfATG8pBlue。重组质粒经进一步用限制性内切酶HindIII与XbaI双酶切鉴定可检测到两个条带，分别为GFP-SfATG8和AcMNPVgp64基因的poly（A）序列（1301bp）以及pBluescriptSK(-)载体和AcMNPVie1基因的启动子序列（约3.5kb）（图3-5）。重组质粒测序正确后，转染Sf9细胞并在转染12小时后用野生型AcMNPV（MOI=5）感染细胞。在病毒感染后0.5-48小时用倒置荧光显微镜拍照（图3-6）并收集细胞用GFP抗体进行Westernblot检测（图3-7）。显微镜观察的结果显示，在病毒感染后1-12小时，Sf9细胞内表达的GFP-ATG8均呈弥散状分布于细胞质中，并未形成代表自噬体的荧光斑点；与对照细胞（病毒未感染）比较发现，个别细胞中呈现的个别荧光斑点可能只是细胞中低水平的背景自噬。相比较而言，在病毒感染后18-48小时，特别在感染后36-48小时，Sf9细胞内荧光斑点的数量和大小都显著增加，表明细胞内明显发生了自噬（图3-6）。Westernblot检测结果显示，在病毒感染后1-24小时仅能检测到单一的GFP-ATG8条带，并未出现ATG8-PE条带；然而，在病毒感染后36小时和48小时则出现了明显的GFP-ATG8-PE条带，表明在病毒感染后36小时Sf9细胞内明显发生了自噬。我们推 第三章结果与分析39测在病毒感染后18小时，Sf9细胞内即发生了自噬，但18-24小时期间的自噬水平较低，以至于灵敏度较低的Westernblot无法检测到ATG8-PE条带。这些结果表明，在AcMNPV感染晚期诱导Sf9细胞显著发生了自噬。图3-5GFP-SfATG8pBlue质粒酶切分析Figure3-5Restrictionenzyme-digestanalysisoftheplasmidGFP-SfATG8pBlueM:250bpDNAMarker;1:GFP-SfATG8pBlueI)0h-ATG8ii)1h-ATG8iii)3h-ATG8iv)6h-ATG8v)12h-ATG8vi)18h-ATG8vii)24h-ATG8viii)36h-ATG8ix)48h-ATG8图3-6AcMNPV侵染过程中Sf9细胞中GFP-ATG8分布情况（比例尺：20μm）Figure3-6ThedistributionofGFP-ATG8inAcMNPV-infectedSf9cells,Scalebar:20μm 40昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探图3-7Westernblot分析AcMNPV感染的Sf9细胞中GFP-ATG8的表达GP64用于指示病毒感染，β-actin作为上样量参照Figure3-7WesternblotanalysisoftheexpressionofGFP-ATG8inAcMNPV-infectedSf9cellsTheblotsofGP64isusedtoindictethevirusinfection,whereastheblotsofβ-actinwereservedasaloadingcontrol.3.5RNA干扰ATG14与ATG101对AcMNPV感染的影响为了初步了解自噬相关基因在杆状病毒感染中的作用。根据上述各自噬相关基因在AcMNPV感染后的转录水平变化，我们首先挑选了核心ATG中表达量明显上调的ATG14和表达量明显下调的ATG101作为研究对象进行RNA干扰。通过转染基因特异性dsRNA以及对照GFP的dsRNA，我们发现Sf9细胞中ATG14和ATG101的表达量显著下降，其干扰效率都达到了80%以上。随后，使用重组病毒AcMNPV-LacZ-GUS（LacZ与GUS两个报告基因的表达分别由AcMNPV极早期基因ie1的启动子与晚期基因p6.9的启动子控制）感染RNA干扰处理后的Sf9细胞，我们发现干扰ATG14和ATG101的表达致使病毒感染后6小时Sf9细胞中β-Gal活性显著高于转染GFPdsRNA的对照组（图3-9）；在病毒感染晚期（感染后24小时）收集感染细胞的裂解液中测定的GUS活性在各处理组之间无显著性差异（图3-10）。我们推测RNA干扰抑制ATG14与ATG101的表达显著促进了病毒入侵Sf9细胞。 第三章结果与分析41(copies/cell)TranscriptLevels(copies/cell)TranscriptLevelsdsRNAdsRNA图3-8转染dsRNA后Sf9细胞中ATG14与ATG101的转录水平Figure3-8TranscriptlevelsofATG14andATG101inSf9cellstransfectedwiththecontrolorgene-specificdsRNA***Beta-GalActivity(%)dsRNA图3-9抑制ATG14与ATG101表达对AcMNPV极早期启动子指导的报告基因LacZ表达的影响Figure3-9EffectsofknockdowntheexpressionofATG14andATG101ontheexpressionofthereportergeneLacZdirectedbyAcMNPVimmediatelyearlypromoterGUSActivity(%)dsRNA图3-10抑制ATG14与ATG101的表达对AcMNPV晚期启动子指导的报告基因GUS表达的影响Figure3-10EffectsofknockdowntheexpressionofATG14andATG101ontheexpressionofthereportergeneGUSdirectedbyAcMNPVlatepromoter 42昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探第四章结论与讨论目前，较多的研究表明自噬途径在昆虫发育和免疫调控等生理或病理过程中发挥重要作用（Weietal.，2012；Xieetal.，2016；Lvetal.，2018；Psathakietal.，2018）然而，关于自噬与昆虫杆状感染的相互作用关系尚不清楚。在本文中，我们选择来自6个目的13种已完成全基因组测序的昆虫作为检索对象，系统解析了自噬相关基因在昆虫基因组中的分布。通过序列比对，我们在13种昆虫基因组中挖掘到40多个自噬相关基因的同源序列（表3-1，3-2）。这些自噬相关基因大部分是参与经典自噬途径或多种选择性自噬途径的非选择性自噬相关基因，也有一部分基因可能仅特异性地参与某一种选择性自噬途径。值得一提的是，相比较人类基因组中多个自噬相关基因存在的基因扩增现象，昆虫基因组中自噬相关基因的扩增数量和程度都较低。尽管个别自噬相关基因在某些昆虫基因组中缺失，但绝大多数自噬相关基因高度保守地存在于已测序的昆虫基因组中。杆状病毒是一类特异性感染昆虫的大分子双链DNA病毒。研究表明，AcMNPV感染Sf9细胞后会通过PI3K-AKT信号通路诱导细胞发生凋亡，抑制该通路会显著降低病毒产量（Xiaoetal.，2009）揭示自噬对AcMNPV感染具有重要作用。近期的研究发现，AcMNPV感染甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）细胞后0-12小时，自噬关键基因ATG5的表达量显著升高（Liuetal.，2016）。在AcMNPV感染粉纹夜蛾细胞后不同时间的转录组数据中，大量免疫相关基因的转录水平在病毒感染后有显著的变化（Chenetal.，2014）。采用定量PCR技术，我们验证了AcMNPV感染后粉纹夜蛾细胞中39个自噬相关基因的转录水平（图3-1和图3-2），同时也检测了AcMNPV感染后草地贪夜蛾细胞中40个自噬相关基因的转录水平（图3-3和图3-4），结果显示大多数（约30个）自噬相关基因的转录水平在病毒感染后在两种细胞系中呈现类似的变化趋势，揭示AcMNPV诱导的自噬基因表达变化不依赖于宿主细胞的特异性。研究表明，ATG8在酵母、哺乳动物和多种昆虫之间同源性较高，可作为标志蛋白指示昆虫自噬的发生情况（Gaietal.，2013；Zhangetal.，2014）。我们采用GFP标签ATG8同源蛋白GABARP，荧光显微镜观察结合Westernblot检测结果显示，在AcMNPV感染Sf9细胞后1~12小时，Sf9细胞内的自噬水平都较低（图3-6和图3-7），而在感染后18-48小时，特别是感染后36-48小时细胞的自噬水平显著升高。随后的RNA干扰分析表明，抑制ATG14和ATG101的表达显著促进AcMNPV极早期启动子指导的报告基因的表达，但不影响病毒晚期启动子指导的报告基因的表达，暗示抑制自噬途径促进AcMNPV早期复制阶段。我们推测，抑制ATG14或ATG101的表达可能促进AcMNPV出芽型病毒的入侵。目前，我们仍在进一步验证病毒入侵是否与抑制ATG14或ATG101的表达直接相关。 第四章结论与讨论43综上所述，本论文系统解析了自噬相关基因在昆虫基因组中的分布并对AcMNPV感染Tnms42和Sf9两种细胞后自噬相关基因的转录水平及Sf9细胞中自噬发生水平进行了检测。随后，采用RNA干扰技术初步探究了自噬相关基因对病毒入侵不同阶段的影响。该研究结果为进一步深入分析宿主自噬途径与杆状病毒互作相互关系奠定了一定的基础。 44昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探参考文献AitsSandJäätteläM.2013.Lysosomalcelldeathataglance.JournalofCellScience,126:1905~1912Ait-GoughoulteM,KandaT,MeyerK,RyerseJS,RayRB,RayR.2008.HepatitisCvirusgenotype1agrowthandinductionofautophagy.JournalofVirology,82(5):2241~2249AkinduroO,SullyK,PatelA,RobinsonDJ,ChikhA,McPhailG,BraunKM,PhilpottMP,HarwoodCA,ByrneC,etal.2016.Constitutiveautophagyandnucleophagyduringepidermaldifferentiation.JournalofInvestigativeDermatology,136:1460~1470AndingALandBaehreckeEH.2017.Cleaninghouse:selectiveautophagyoforganelles.DevelopmentalCell,41(1):10~22AshfordTPandPorterKR.1962.Cytoplasmiccomponentsinhepaticcelllysosomes.JournalofCellularBiochemistry,12:198~202AyresMD,HowardSC,KuzioJ,LopezM,PosseeRD.1994.ThecompleteDNAsequenceofAutographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus.Virology,202:586~605BaldridgeMT,TurulaH,WobusCE.2016.Norovirusregulationbyhostandmicrobe.TrendsinMolecularMedicine,22(12):1047~1059Beas-CatenaA,Sanchez-MironA,Carcia-CamachoF,Contreras-GomezA,Molina-GrimaE.2014.Baculovirusbiopesticides:Anoverview.TheJournalofAnimal&PlantSciences,24(2):362~373BellotG,Garcia-MedinaR,GounonP,ChicheJ,RouxD,Pouysse´gurJ,MazureNM.2009.Hypoxia-inducedautophagyismediatedthroughhypoxia-induciblefactorinductionofBNIP3andBNIP3LviatheirBH3domains.MolecularandCellularBiology,29(10):2570~2581BergerI,GarzoniF,ChailletM,HaffkeM,GuptaK,AubertA.2013.ThemultiBacproteincomplexproductionplatformattheEMBL.JournalofVisualizedExperiments,77:e50159BerlingM,Blachere-LopezC,SoubabereO,LeryX,BonhommeA,SauphanorB,Lopez-FerberM.2009.Cydiapomonellagranulovirusgenotypesovercomevirusresistanceinthecodlingmothandimprovevirusefficiencybyselectionagainstresistanthosts.AppledandEnvironmentalMicrobiology,75(4):925~930BerrymanS,BrooksE,BurmanA,HawesP,RobertsR,NethertonC,MonaghanP,etal.2012.Foot-and-mouthdiseasevirusinducesautophagosomesduringcellentryviaaclassIIIphosphatidylinositol3-kinase-independentpathway.JournalofVirology,86(23):12940~12953BieringSB,ChoiJ,HalstromRA,BrownHM,BeattyWL,LeeS,McCuneBT,DominiciE,etal.2017.ViralreplicationcomplexesaretargetedbyLC3-guidedinterferon-inducibleGTPases.CellHost&Microbe,22:1~12BlazquezA,Martin-AcebesMA,SaizJ.2015.Aminoacidsubstitutionsinthenon-structuralproteins4Aor4BmodulatetheinductionofautophagyinWestNilevirusinfectedcellsindependentlyoftheactivationoftheunfoldedproteinresponse.FrontiersinMicrobiology,5:791BlissardGW.1996.Baculovirus-insectcellinteractions.Cytotechnology,20:73~93 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52昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探ShiJ,WongJ,PiesikP,FungG,ZhangJ,JagdeoJ,LiX,JanE,LuoH.2013.Cleavageofsequestosome1/p62byanenteroviralproteaseresultsindisruptedselectiveautophagyandimpairedNFKBsignaling.Autophagy,9(10):1591~1603SmithGE,SummersMD,FraserMJ.1983.Productionofhumanbetainterferonininsectcellsinfectedwithabaculovirusexpressionvector.MolecularandCellularBiology,3(12):2156~2165StaringJ,CastelmurE,BlomenV,HengleL,BrockmannM,BaggenJ,etal.2017.PLA2G16representsaswitchbetweenentryandclearanceofPicornaviridae.Nature,541:412~416SumpterR,SirasanagandlaS,FernandezAF,WeiY,DongX,FrancoL,ZouZ,MarchalC,LeeMY,ClappDW,HanenbergH,LevineB.2016.Fanconianemiaproteinsfunctioninmitophagyandimmunity.Cell,165:867~881SunX.2015.HistoryandcurrentstatusofdevelopmentanduseofviralinsecticidesinChina.Viruses,7:306~319TalloczyZ,JiangW,VirginHW,LeibDA,ScheunerD,KaufmanRJ,EskelinenE,LevineB.2002.Regulationofstarvation-andvirus-inducedautophagybytheeIF2alphakinasesignalingpathway.PNAS,99(1):190~195TanakaC,TanLJ,MochidaK,KirisakoH,KoizumiM,AsaiE,SakohNakatogawaM,OhsumiY,NakatogawaH.2014.Hrr25triggersselectiveautophagy-relatedpathwaysbyphosphorylatingreceptorproteins.TheJournalofCellBiology,207(1):91~105TanidaI,UenoT,KominamiE.2004.LC3conjugationsysteminmammalianautophagy.Theinternationaljournalofbiochemistry&cellbiology,36(12):2503~2518TripathiDNandWalkerCL.2016.Theperoxisomeasacellsignalingorganelle.CurrentOpinioninCellBiology,39:109~112ValeraM,Armas-RilloL,Barroso-GonzalezJ,ZiglioS,BatisseJ,DuboisN,etal.2015.TheHDAC6/APOBEC3GcomplexregulatesHIV-1infectivenessbyinducingVifautophagicdegradation.Retrovirology,12:53VanOersMM,PijlmanGP,VlakJM.2015.Thirtyyearsofbaculovirus-insectcellproteinexpression:fromdarkhorsetomainstreamtechnology.JournalofGeneralVirology,96:6~23VerlhacP,ViretC,FaureM.2015.DualfunctionofCALCOCO2/NDP52duringxenophagy.Autophagy,11(6):965~966.WangL,TianY,OuJJ.2015.HCVinducestheexpressionofRubiconandUVRAGtotemporallyregulatethematurationofautophagosomesandviralreplication.PLoSPathogens,11(3):e1004764WangMandKaufmanRJ.2016.Proteinmisfoldingintheendoplasmicreticulumasaconduittohumandisease.Nature,529:326~335WangM,WangJ,YinF,TanY,DengF,ChenX,JehleJA,VlakJM,HuZ,WangH.2014.Unravelingtheentrymechanismofbaculovirusesanditsevolutionaryimplications.JournalofVirology,88(4):2301~2311WeiY,SinhaS,LevineB.2008.DualroleofJNK1-mediatedphosphorylationofBcl-2inautophagyandapoptosisregulation.Autophagy,4(7):949~951WeiW,GaiZ,AiH,WuW,YangY,PengJ,HongH,LiY,LiuK.2012.Baculovirusinfectiontriggersashiftfromaminoacidstarvation-inducedautophagytoapoptosis.PLoSOne,7(5):e37457 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54昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探附录附录1Tnms42细胞中自噬相关基因在AcMNPV感染后转录水平SupplementalTable1mRNAexpressinglevelsofautophagyrelatedgenesinTnms42cellsinfectedbyAcMNPV 致谢55致谢时间真的很神奇，三年的研究生生活在不经意间便已接近尾声。回想这段时光，研一刚来报到时的种种场景还能清晰地浮现在眼前，仿佛就发生在不久前一样。在这三年的日子里我收获了很多，也成长了很多。值此毕业之际，衷心地向这三年来所有关心我和帮助我的人送上我最真挚的祝福！我最要感谢的人是我的导师李朝飞老师。正是李老师的指导与帮助，使我在专业知识、实验技术和对科研的认识等方面都有了巨大的提升。我的毕业论文从选题，到实验设计，再到具体的实验过程都离不开李老师的悉心指导。李老师对于科研的热情、对待科研工作中各方面严谨和认真的态度以及工作中的勤勉都一直深深的影响着我，也让我明白了什么是一个优秀的科研工作者该有的样子。在今后的科研道路上，李老师将永远是我努力学习的榜样，能够成为李老师的学生，是我的幸运。谨在此向您表达我最崇高的敬意和衷心的感谢！祝愿您和您的家人身体健康，生活幸福！感谢实验室全体成员的陪伴与帮助。感谢于乾龙师姐在实验上耐心的指导，刚开始做实验时我对分子生物学的实验一无所知，是你带着我从最基础的实验开始，一步步掌握了很多实验技术。每次教我做实验，你都会一边演示，一边把实验原理和注意事项详细的讲一遍，在你的帮助下我进步了很多，不但在实验上打下了扎实的基础，也养成了良好的实验习惯。祝愿你能以一个良好的状态回归实验室，并顺利博士毕业！感谢岳琦师姐细心地教会了我做Westernblot，祝你博士顺利毕业，也提前祝你新婚快乐！感谢刘婷婷师姐在科研方面的交流与帮助，祝你早日完成博士学业！感谢已经毕业的高晋丽师姐、杨琪师姐、郭亚师姐和王哲师兄，祝你们前程似锦！感谢李玉英同学和孙雨同学这三年来陪我并肩奋斗，祝你们在今后的学习和生活中一帆风顺！感谢刘希萌师妹和乔斌师弟在实验和生活中对我的帮助，希望你们能继续为实验室多做贡献，学业有成！感谢王敦教授、吕志强教授、陈茂华教授、刘同先教授等在论文开题、中期考核以及平时的学习过程中给我提出的建议和帮助。祝愿你们工作顺利，生活愉快！感谢我的室友白宇、冯瑞瑞和申永铭。感谢你们在日常学习和生活中对我的关心和帮助，你们给我原本平淡的硕士生活增添了无限的乐趣。祝愿你们在今后都能够事业有成，飞黄腾达！我还要感谢我的家人，感谢你们这么多年来对我的包容和支持。无论我遇到什么困难和困惑，你们的鼓励都是我坚持下去的最大动力！最后，再次向所有帮助过我的人道一声感谢！祝你们心想事成，平安快乐！李景峰 56昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探作者简介李景峰，内蒙古包头人，中共党员，2010年考入西南大学植物保护学院植物保护专业，2014年本科毕业获农学学士学位。2015年考入西北农林科技大学植物保护学院农业昆虫与害虫防治专业攻读硕士学位，导师为李朝飞教授，方向为昆虫生理与生化，主要研究项目为昆虫自噬途径与杆状病毒模式种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒侵染之间的关系。论文发表情况：JingfengLi,YuSun,YuyingLi,XimengLiu,QiYue,ZhaofeiLi*.InhibitionofcellularfattyacidsynthaseimpairsreplicationofbuddedvirionsofAutographacalifornicamultiplenucleopolyhedrovirusinSpodopterafrugiperdacells.VirusResearch,2018,252:41~47