布鲁氏菌侵染巨噬细胞后对自噬—溶酶体降解途径的影响

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1、分类号：密级：学号：2012018014单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌侵染巨噬细胞后对自噬-溶酶体降解途径的影响学位申请人王浩陈创夫教授指导教师郭飞副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月TheinfluenceofBrucellaonautophagiclysosomaldegradationpathwayADissertationSubmittedtoShiheziUniversity

2、InPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByWangHao(BasicVeterinaryScience)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuang-FuJune,2015Shihezi,Xinjiang,China石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经

3、注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。课题来源国家自然科学基金项目名称：与Nrdp1和SOC

4、S-1互作的布鲁氏菌蛋白的筛选及其作用的分子机制的研究项目编号：31260596项目名称：布鲁氏菌感染巨噬细胞后阻滞自噬-溶酶体降解途径的机制研究项目编号：81360239中文摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病,是由布鲁氏菌属(Brucella)的布鲁氏菌侵入机体，引起的一种慢性人畜共患传染病病。该病在世界范围内广泛流行，严重危害公共卫生安全，并造成畜牧业经济巨大损失。巨噬细胞是布鲁氏菌感染的首要宿主细胞，布鲁氏菌感染巨噬细胞后可以激发不依赖Atg5（Autophagyrelate

5、dgene5）的自噬，且逃避其溶酶体的降解。自噬相关蛋白Atg5和膜融合相关蛋白Tecpr1（Tectonindomain-containingprotein）的结构域AIR（Atg12-Atg5-interactingregion）在促进自噬体与溶酶体的融合中有着重要作用，但在布鲁氏菌诱导的自噬中这两种蛋白的作用尚不清楚。目的：探究Atg5和AIR结构域对羊种布鲁氏菌16M感染小鼠巨噬细胞RAW264.7引起的非典型自噬中自噬体与溶酶体的融合及对16M胞内生存繁殖能力的影响。方法：通过分子生物

6、学手段分别构建表达Atg5和沉默AIR的慢病毒载体；重组慢病毒质粒、包装质粒、包膜质粒三质粒共转染到293T细胞包装慢病毒，转染48h后通过观察绿色荧光鉴定病毒包装是否成功；将包装好的病毒进一步感染RAW264.7,QRT-PCR检测Atg5和AIR的表达。用羊种布鲁氏菌16M菌株分别感染表达Atg5和沉默AIR基因的RAW264.7细胞，并以感染正常RAW264.7细胞为空白对照；感染4h、12h、24h、48h后，通过CFU计数实验检测胞内存活的布鲁氏菌数量，并通过激光共聚焦检测布鲁氏菌感染

7、24h后细胞内自噬体与溶酶体融合的情况。QRT-PCR检测布鲁氏菌感染24h后自噬相关蛋白LC3ⅠⅡ/、p62在mRNA水平上的表达情况，Westernblot检测自噬相关蛋白LC3ⅠⅡ/、p62的蛋白表达量。结果：限制性内切酶双酶切鉴定以及DNA测序表明Atg5和AIR重组慢病毒质粒构建成功；慢病毒包装实验发现重组病毒转染细胞后可观察到细胞内有许多绿色荧光点。QRT-PCR实验结果表明表达Atg5和沉默AIR慢病毒载体转染成功。布鲁氏菌感染过表达Atg5和沉默AIR的RAW264.7后，激光共

8、聚焦结果显示实验组的自噬体和溶酶体融合情况明显高于对照组(P<0.05)。QRT-PCR和Westernblot实验表明，与对照组相比，布鲁氏菌感染过表达Atg5的RAW264.7后，自噬相关蛋白LC3ⅠⅡ/、p62的表达量下降（P<0.05）。细菌胞内生存CFU实验表明，与对照组相比，布鲁氏菌16M感染过表达Atg5和沉默AIR基因的巨噬细胞后，胞内细菌数明显降低（P<0.05）。结论：在布鲁氏菌16M感染RAW264.7细胞诱发的非典型自噬中，过表达Atg5和沉默AIR会通过促进自噬体与溶酶