白介素-2(IL-2)对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞(MΦ)的调节作用.pdf

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1、白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用分类号：密级：学号：2015200533单位代码：10759石河子大学硕士学位论文白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞（MΦ）的调节作用学位申请人齐江姣指导教师高剑峰教授申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称生物化学与分子生物学研究方向动物基因工程所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2018年6月白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬

2、细胞的调节作用EffectofIL-2onmacrophageregulationofBrucellainfectioninmiceADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFμLfillmentoftheReqIUrementsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByQiJiang-jiao(BiochemistryandMolecμLarBiology)DissertationSupervisor:Prof.GaoJian-fengJune.2018白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染

3、腹腔巨噬细胞的调节作用白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用I白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用II白介素-2（IL-2）对布鲁氏菌侵染腹腔巨噬细胞的调节作用摘要目的：分别用GFP/RFP的整合布鲁氏杆菌M5/16M（以下简称GFP-M5和RFP-16M）侵染腹腔巨噬细胞（MΦ）,检测白介素-2（IL-2）调节作用下，被GFP-M5和RFP-16M侵染的MΦ培养不同时间所释放的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、γ-干扰素（IFN-γ）、NO因子的含量；CFU测定MΦ内GFP-M5和RFP-16M的活菌数，并计算MΦ的吞噬指数，判断MΦ的吞噬

4、及其杀菌能力；利用血球计数板和倒置荧光显微镜，计算荧光细胞数，以此来计算MΦ的吞噬率；台盼蓝染色检测不同浓度和时间点被侵染后MΦ的存活率；观察在不同时间点和不同浓度IL-2作用下，被侵染后MΦ的增殖变化；利用RT-PCR和凝胶电泳技术验证MΦ不表达并分泌IL-2；以此来探讨IL-2对MΦ在被GFP-M5和RFP-16M侵染后的免疫调节的作用，为临床运用IL-2及治疗布病提供新的思路和理论依据。方法：1、将正常的布鲁氏菌16M株与RFP-16M培养至对数期后收集菌体，用麦氏比浊管配置好所需菌液的浓度，依照细菌和细胞的比例为100：1进行侵染，利用平板计数法来比较正常细菌16M与RFP

5、-16M在胞内的存活能力；2、利用ELISA试剂盒，按照说明书操作，通过酶标仪分别检测不同浓度IL-2和不同时间点作用下，被侵染的MΦ释放的TNF-α、IFN-γ、NO因子的含量；3、依据菌落形成单位（CFU）的方法，将不同浓度IL-2和各时间点作用下的被侵染细胞，用细胞裂解液裂解、PBS稀释，然后涂布于布鲁氏菌固体培养基，72h后进行菌落计数，计算各浓度、各时间点菌落数目和细胞的比例，得出MΦ吞噬指数；4、在血球计数板和光学显微镜下，观察不同浓度IL-2和各时间点作用下的被侵染的MΦ的增殖变化；结合台盼蓝染色法，计算细胞死亡数，以此计算MΦ存活率；5、使用血球计数板和激光共聚焦显

6、微镜，根据GFP-M5和RFP-16M只在MΦ胞内表达荧光蛋白的特性，计数发光细胞数目和总细胞数目，从而计算MΦ吞噬率；6、提取MΦ的RNA，利用RT-PCR试剂盒，反转录出模板cDNA，经过PCR技术进行扩增，观察MΦ本身基因序列是否转录出表达IL-2的mRNA。结果：1、通过CFU结果显示，RFP-16M对比正常的布鲁氏菌16M在不同时间阶段的细菌，发现两者生长状况无明显的差异，说明pMC-221载体对细菌体侵染小鼠MΦ的能力无影响；IL-2促进了MΦ吞噬RFP-16M的能力，随着侵染时间的增长和IL-2浓度的增加，胞内活菌数降低，存在时间和浓度依赖性，说明了MΦ的杀菌能力逐渐

7、增强（IL-2为0×106IU，0h时，菌落数858.667±48.222；IL-2为5×106IU，24h时，菌落数285.667±7.572）；2、利用ELISA试剂盒，按照说明书操作，通过酶标仪检测发现IL-2调节被GFP-M5侵染的MΦ所释放的细胞因子（TNF-α、IFN-γ和NO）的含量（GFP-M5侵染，IL-2为5×106IU，12h与0h对比：123.902±13.249与11.092±3.152；67.083±26.675与5.346±0.835；1