布鲁氏菌对巨噬细胞极化及STAT6信号通路的影响研究.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015201703单位代码：10759石河子大学硕士学位论文布鲁氏菌对巨噬细胞极化及STAT6信号通路的影响研究学位申请人王月丽指导教师陈创夫教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2018年6月EffectsofBrucellaonMacrophagePolarizationandSTAT6SignalingPathwayADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheReq

2、uirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWangYueli(BasicVeterinaryMedicine)DissertationSuPervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2018课题来源1.国家自然科学基金项目“STAT6介导的信号通路在布氏杆菌16M感染的子宫和胎盘中的免疫作用”。项目编号：31660705。中文摘要布鲁氏菌病是一种严重的人兽共患病，布鲁氏菌侵入机体后，经历短暂的急性期后很容易转成慢性感染，主要寄生在宿主的巨噬细胞内，而巨噬细胞可根据体内微环境的不同，极化为不同的

3、表型发挥不同的功能。布鲁氏菌感染对巨噬细胞的极化影响很大，但其具体分子机制尚未系统研究，本文主要研究布鲁氏菌感染巨噬细胞后对其极化方向的影响，以及对参与抗炎反应和组织修复功能的M2型和参与调控M2的信号通路STAT6的影响。目的：本研究以布鲁氏菌强毒株16M、S2308和布鲁氏菌弱毒株M5和RB51为研究对象，探讨布鲁氏菌对巨噬细胞极化方向的影响以及STAT6信号通路对布鲁氏菌胞内生存的影响，并在小鼠体内验证STAT6的表达情况，最后验证布鲁氏菌外膜蛋白Omp10和脂多糖蛋白Per对巨噬细胞极化的影响以及对STAT6信号通路的影响。方法：（1）分离获取小鼠

4、骨髓细胞，以M-CSF诱导巨噬细胞分化，后加入IL-4刺激向M2型分化。流式细胞术鉴定巨噬细胞分化程度及M2型巨噬细胞极化比例；qRT-PCR检测M2型转录因子JAK1、STAT6、ARG1、Ym1、IL-10的mRNA相对表达量；再通过免疫荧光技术检测M2型标志因子ARG1、CD206；最后利用ELISA检测M2型细胞因子IL-10的表达情况。（2）利用羊种布鲁氏菌16M和M5，牛种布鲁氏菌S2308和RB51侵染细胞，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β和M2型巨噬细胞标志因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10m

5、RNA表达水平。然后利用WesternBlot检测STAT6信号通路的激活状态。其次利用流式细胞术检测M1/M2标志性表面标记CD86和CD206的表达比例。再通过ELISA检测M1/M2型细胞因子TNF-α、IL-12、IL-4、IL-10的表达。最后进行CFU计数。（3）建立小鼠攻毒模型，分别于攻毒3、9、15、30、45天后断尾采血，ELISA方法检测小鼠体内细胞因子IL-12、IL-10、IL-4，IFN-γ的表达量。处死后无菌取出其心，肝，脾，肺，肾，子宫，提取各组织RNA，qRT-PCR方法检测，各组织内STAT6mRNA的表达水平；并做CFU

6、计数；HE染色观察组织的病变；免疫组化检测不同组织中布鲁氏菌与STAT6、p-STAT6的表达。（4）首先纯化重组表达蛋白Omp10和Per，再分别刺激巨噬细胞，qRT-PCR检测M1型标志因子NOS2和IL-12，M2型标志因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10mRNA表达水平；然后流式细胞仪检测蛋白刺激细胞后CD86和CD206的表达。ELISA方法检测Th1/Th2型细胞因子TNF-α和IL-10的表达量。结果：（1）在分化第8天时，巨噬细胞比例达95%。经IL-4诱导24h后，JAK1、STAT6、ARG1、Ym1、IL-10mRNA相对表

7、达量均显著上调；ARG1、CD206荧光表达量均达到90%以上且M2型巨噬细胞标志CD206比例达97%；IL-10的表达量显著高于对照组。（2）布鲁氏菌侵染细胞前期高表达M1相关因子p65、NOS2、IL-1β和CD86，而后期高表达M2相关因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10和CD206。布鲁氏菌在感染72h时激活STAT6信号通路，且强毒株16M和S2308强于弱毒株M5。加入STAT6抑制剂后，抑制IL-4、IL-10的表达；促进TNF-α、IL-12的表达。布鲁氏菌感染分别激I活和抑制STAT6后的细胞，加入IL-4激活STAT6后，胞

8、内载菌量高于对照组，而加入AS抑制STAT6后，胞内载菌量低于对照